[发明专利]一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒及其鉴定方法

权利要求书

1.一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒，该试剂盒由酶标反应板和相关试剂构成，所述的相关试剂有以下部分：

(1)抗血清：PsY₅A，所述的PsY₅A抗血清是通过检测菌株的致病性筛选致病力强的烟草野火病Pseudomonas syringae pv.tabaci Y₅菌株为抗原，通过免疫注射健康新西兰大耳兔，按照颈动脉放血方法获得；

(2)0.05M pH9.6包被缓冲液，所述的包被缓冲液用Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水至1000ml制得；

(3)0.01M pH7.4磷酸缓冲液；

(4)1×PBST洗涤液，所述的1×PBST洗涤液为吐温-200.5ml加0.01M pH7.4磷酸缓冲液至1000ml；

(5)pH5.4的底物缓冲液，其中A液为0.1M柠檬酸2.22ml；B液为0.1MNa₂HPO₄2.78ml加蒸馏水10ml；

(6)四甲基联苯胺底物反应液，所述的四甲基联苯胺底物反应液由四甲基亚砜配制成10mg/ml四甲基联苯胺100μl，加入0.65％H₂O₂25μl，再加入上述底物缓冲液至10μl；

(7)金黄色葡萄球菌A蛋白纯品及辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白，所述的金黄色葡萄球菌A蛋白纯品的工作浓度为2.5μg/ml，以包被缓冲液先配成1mg/ml母液，4℃贮备；所述的辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白的工作浓度为1∶40；

(8)阳性对照物为烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Y₅株系的菌悬液，菌体浓度为5×10⁸cells/ml。

2.根据权利要求1所述的试剂盒对烟草野火病菌的鉴定方法，该方法按以下步骤进行：

(1)供试样品的处理，将样品混匀，称取种子或烟株组织5g放入研钵中，加入0.01M磷酸盐缓冲液20ml研磨，静置3h～4h，备用。

(2)用所述的快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒鉴定(1)中所述的样品处理液，并依如下步骤进行：

①包被金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为2.5μg/ml，200μl/孔，4℃过夜；

②加入用0.01M磷酸缓冲液稀释5000倍的一抗，200μl/孔，37℃孵育3h或4℃过夜，0.01M PBST洗板5次，5min/次；

③加入供试样品处理液，200ul/孔，37℃孵育3h；

④用0.01M PBST洗板5次，5min/次；

⑤加入用0.01M磷酸缓冲液稀释2000倍的二抗，200μl/孔，37℃孵育2h或4℃过夜，洗涤同④；

⑥加入辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白，其工作浓度为1∶40，200ul/孔，37℃孵育2h或4℃过夜，洗涤同④；

⑦加入四甲基联苯胺底物反应液，100μl/孔，37℃孵育10～20min；

⑧加入2M H₂SO₄终止反应，50μl/孔，在酶联免疫检测仪上读OD450值，P/N＞2.0判为阳性。

(3)阳性对照为烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Y₅株系的菌悬液，菌体浓度为5×10⁸cells/ml；

(4)空白对照为无菌水。