[发明专利]一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒及其鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物病原细菌的免疫测定法技术领域，具体涉及对烟草野火病菌进行鉴定的试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

烟草野火病(其病原学名为Pseudomonas syringae pv.tabaci)是由烟草假单胞杆菌引起的细菌性病害。20世纪90年代以来，由于生产上大面积种植感病品种和品种单一等原因，该病害成为烟草生产上的一大难题。我国所有种烟省区皆有发生，尤以黑龙江、吉林、辽宁、山东、四川、云南等烟区发病较为严重，许多烟田发病率高达40％以上，有的甚至达100％，造成绝产绝收。烟草感病后严重影响烤烟品质及产量，为预防烟草野火病的危害，对烟草野火病菌其进行快速、准确的鉴定是防效的关键之一。

现代血清学技术的迅速发展，为细菌性病害的种类鉴定、种群动态分布、发生流行规律研究及监测提供了快速、灵敏、准确的方法。

血清学技术是以抗原、抗体为基础，利用抗原-抗体的特异性反应来检测、鉴定病原的。常用的血清学方法包括凝集反应测定法(包括有玻片凝集反应和试管凝集反应)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA，简称ELISA法)等。ELISA法是目前植物细菌性病害诊断上应用较广泛的一种免疫学方法(张爱红等，2008，几种植物病原细菌的检测技术和鉴定技术，河北农业科学，12(8)：30-32)。

对于植物病原菌检测，最近使用最多的是金黄色葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附测定法(简称SPA-ELISA法)，该方法在保持了ELISA法中的双抗夹心法灵敏度的同时，免除了制备两种抗体的麻烦，同时由于金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)本身的特性，大大缩短了与抗体孵育的时间。

但是，上述血清学方法在检测和鉴定植物病原细菌方面各有优点，但也存在一些缺陷，如凝集反应的优点在于简便、快速，但灵敏度和专化性中等，而SPA-ELISA灵敏度和专化性都很好。

长期以来对于烟草野火病的鉴定和检测主要是根据症状学特征，病原菌形态特征和生理生化特性，存在耗时较长、灵敏性、准确性较差的不足。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定烟草野火病菌的试剂盒及其用该试剂盒鉴定烟草野火病菌的方法，该试剂盒及其用该试剂盒鉴定烟草野火病菌方法能简便、快速、灵敏、准确地鉴定烟草野火病。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是提供一种快速鉴定烟草野火病菌的试剂盒，该试剂盒由酶标反应板和相关试剂构成，所述的相关试剂有以下部分：

(1)抗血清：PsY₅A，所述的PsY₅A抗血清是通过检测菌株的致病性筛选致病力强的烟草野火病Pseudomonas syringae pv.tabaci Y₅菌株为抗原，通过免疫注射健康新西兰大耳兔，按照颈动脉放血方法获得。

(2)0.05M pH9.6包被缓冲液(coating buffer，CB，简易配方：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加蒸馏水至1000ml即可)

(3)0.01M pH7.4磷酸缓冲液(PBS)

(4)1×PBST洗涤液：吐温-20(即Tween-20)：0.5ml加0.01M pH7.4PBS至1000ml

(5)pH5.4的底物缓冲液，其中

A液为0.1M柠檬酸2.22ml；

B液为0.1M Na₂HPO₄ 2.78ml加蒸馏水10ml；

(6)四甲基联苯胺底物反应液(即TMB底物反应液)：所述的四甲基联苯胺底物反应液由四甲基亚砜配制成10mg/ml四甲基联苯胺100μl，加入0.65％H₂O₂25μl，再加入上述底物缓冲液至10μl；

(7)金黄色葡萄球菌A蛋白纯品(SPA)及辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)，所述的金黄色葡萄球菌A蛋白纯品的工作浓度为2.5μg/ml，以包被缓冲液先配成1mg/ml母液，4℃贮备；所述的辣根过氧化物酶标记金黄色葡萄球菌A蛋白的工作浓度为1∶40；