[发明专利]利用RNA干扰文库筛选肿瘤转移抑制基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种利用RNA干扰文库和免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型筛选肿瘤转移抑制基因。

背景技术

肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发部位扩散到机体其它部位的现象。统计表明，超过90％的肿瘤患者死亡源于肿瘤转移。肿瘤转移包括：1、肿瘤细胞迁移通过肿瘤组织基底膜；2、进入循环系统，在其中存活并转运；3、在肿瘤继发部位滞留；4、从循环系统渗出；5、浸入肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等过程。由于其复杂性，尽管已对其进行了广泛的研究，肿瘤转移仍然是迄今了解得最少的肿瘤生物学过程。肿瘤转移这一复杂过程是由多种基因调节的。其中有些基因促进肿瘤转移的发生，叫做肿瘤转移促进基因。多年来，利用各种基因过表达手段，人们找到了一些肿瘤转移促进基因，例如，Amf，Hgf/sf，TGF-β，MMP，UPA，β-catenin等。

另一类基因抑制肿瘤转移的发生，叫做肿瘤转移抑制基因。通常，肿瘤转移抑制基因能抑制肿瘤转移而对原发肿瘤生长无影响，在转移病灶中常通过甲基化或转录翻译后修饰等一系列机制表现为表达下调。为了更好地了解肿瘤转移，人们试图进一步揭示肿瘤转移抑制基因在肿瘤转移发射过程中的作用。显而易见，寻找肿瘤转移抑制基因需要通过降低肿瘤转移抑制基因表达来实现。但是，由于没有可靠的降低表达手段，长期以来只确定了非常有限的肿瘤转移抑制基因，目前只有NM23、KNI1、KISS1、MKK4、BrMS1、Gas1等有限的基因符合肿瘤转移抑制基因的定义标准，其中最为明确的是NM23和KNI1。从而使得对肿瘤转移抑制基因的研究、开发、利用无法进行，极大地限制了对肿瘤转移的了解、诊断和治疗。

美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛1998年发现了RNA干扰机制，2006年他们两分享了诺贝尔生理学和医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的肯定，足见RNA干扰在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。这一可以使得基因在体降低表达的机制，也为寻找肿瘤转移抑制基因提供了条件。

最近，有人利用细胞离体培养模型和RNA干扰文库进行肿瘤转移抑制基因的筛选，一些肿瘤细胞株在凝胶基质上进行离体三维细胞培养时，迅速形成与原始细胞团分开的卫星细胞集落。这一过程可以离体模拟肿瘤转移的几个关键步骤：1、从肿瘤组织迁移出去；2、在肿瘤继发部位滞留；3、浸入肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等。RNA干扰文库使得人类基因组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意地降低表达。这样，在肿瘤转移抑制基因降低表达的细胞，进行凝胶基质离体三维细胞培养时，形成卫星细胞集落的能力大大增强，通过克隆形成卫星细胞集落的基因可以确定新的肿瘤转移抑制基因。这一筛选的优点是：1、部分地模拟了肿瘤转移的过程、操作相对简单；2、由于RNA干扰文库可以有效地降低肿瘤转移抑制基因，有利于肿瘤转移的形成，从而有利于筛选到肿瘤转移抑制基因。缺点是由于离体模型不能完全模拟在体肿瘤转移的各个环节和环境的影响，因而：1、筛选到的候选基因只是影响肿瘤转移的部分过程，可能出现假阳性肿瘤转移抑制基因；2、不能筛选到一些影响模型未能模拟的肿瘤转移环节的肿瘤转移抑制基因。

也有人利用免疫缺陷小鼠细胞在体移植肿瘤转移模型和基因过表达文库进行肿瘤转移促进基因的筛选。由于肿瘤转移是多种步骤的的在体过程，其复杂性是任何细胞模型所不能模拟的。因而人们建立了在体研究肿瘤转移的动物模型--免疫缺陷小鼠细胞异体移植模型。就是将肿瘤细胞通过尾静脉注入免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)体内，由于毛细血管丰富，肿瘤细胞在肺部滞留并增殖形成新的肿瘤。这一过程可以在体模拟肿瘤转移的几个关键步骤：1、进入循环系统，在其中存活并转运；2、在肿瘤继发部位滞留；3、从循环系统渗出；4、浸入肿瘤继发部位并增殖形成新的肿瘤等。过表达文库使得人类基因组的各种基因分别在肿瘤细胞株任意地过表达，肿瘤转移促进基因过表达细胞形成转移的能力大大增强。这样，在对照细胞不能形成肿瘤转移的条件下，过表达文库处理的肿瘤细胞也形成了肺肿瘤。通过分离肺肿瘤，并克隆肺肿瘤的过表达基因可以确定新的肿瘤转移促进基因。这一筛选的优点是：1、模拟了体内肿瘤转移的发生过程和环境；2、由于过表达升高肿瘤转移促进基因，有利于肿瘤转移的形成，从而有利于筛选到肿瘤转移促进基因。缺点是过表达升高肿瘤转移抑制基因后，不能形成肿瘤转移抑制基因失活引起的肿瘤转移，因而不利于筛选到肿瘤转移抑制基因。

发明内容