[发明专利]一种饲用β-甘露聚糖酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术领域，尤其涉及一种由黑曲霉(Aspergillus niger)新菌株发酵生产的饲用β-甘露聚糖酶及其制备方法。

背景技术

我国猪、鸡的主要日粮是玉米/豆粕型日粮，尽管单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％，主要原因是豆粕中含有1.3％的β-甘露聚糖，它对动物，包括对人有强大的抗营养作用，影响能量代谢与蛋白质合成。β-甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖等多糖降解为甘露寡糖等低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物各种营养素的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。大量研究表明，甘露寡糖可通过减少动物肠道病原菌，调节免疫反应，提高肠粘膜的完整性而最终提高动物的生产性能，由此已被认为是最有希望的抗生素替代品之一。β-甘露聚糖酶不仅具有一般非淀粉多糖(NSP)酶类的作用，还是一种多功能促生长剂，可促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率。因此可以认为，β-甘露聚糖酶是一种超脱了传统酶制剂的作用，具有提高能量、促进动物生长的新型饲用酶制剂，已引起越来越广泛的关注。

对β-甘露聚糖酶的研究最初是集中在以地衣芽孢、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌等菌株产生的中性或碱性β-甘露聚糖酶上，并主要应用在食品、医药、造纸、采油等领域内，后才逐步有了关于将β-甘露聚糖酶应用于饲料业的报道。国内虽对酸性β-甘露聚糖酶的营养功能及在动物饲料中应用效果研究的报道较多，而对有关酸性β-甘露聚糖酶生产的报道则较少。其中，在有关应用不同菌株所产酸性β-甘露聚糖酶的性质方面也有较大差别：例如，朱劼等分离的黑曲霉WM20-11所产的酸性β-甘露聚糖酶其最适p H为3.5，37℃保温2h在pH2.5～6.0范围内剩余酶活力均在80％以上，其最适作用温度为70℃，且酶在50℃、60℃保温30min时，仍能保持90％左右的活力；皮雄娥等分离的黑曲霉AS6034所产的酸性β-甘露聚糖酶在pH 3.2左右时酶活力达到最大，该酶液在pH 3.8左右较为稳定，保温2h后残留酶活力超过80％，但pH4.0～5.0时酶活力迅速下降，尤其是pH为8.0时酶活力仅为10％左右；李剑芳等分离的黑曲霉LW-1最适pH和最适反应温度分别为3.5和70℃，在pH5.0～8.0时酶活稳定，残余酶活在85％以上，在温度低于60℃时酶活较稳定；张辉分离的青霉QM-1所产的β-甘露聚糖酶最适反应pH为5.8，但pH稳定性和热稳定性未知；韦跃华等将从里氏木霉基因组中获得的内切-甘露聚糖酶全长基因去除内含子后，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pM242；电击法转化毕赤酵母菌株GS115，获得的重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃，在pH5.0～6.0时酶活稳定，在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。

综上所述，从利用不同菌株进行发酵生产酸性β-甘露聚糖酶的已有研究报导来看，以黑曲霉为菌种所生产的酸性β-甘露聚糖酶其最适pH为3.5左右，这与动物的胃液酸度相仿是较适宜作为饲料添加剂的；但是饲料在其制备的过程中一般都要经过高温的造粒过程；同时，在动物体内从肠到胃其pH值的变化是较大的，因而对作为饲料添加剂的酶来讲，对其耐热的稳定性与对pH的稳定性均有较高的要求；然而已报道的黑曲霉菌株所产酸性β-甘露聚糖酶对热与pH的稳定性是不高的。

发明内容

本发明目的是，针对上述现有黑曲霉菌株所产β-甘露聚糖酶，所存在对热稳定性和pH稳定性不高的缺陷，筛选一种能以丰富、廉价农副产品为发酵原料，所产β-甘露聚糖酶对热和pH稳定性较强的黑曲霉新菌株；本发明的另一目的是提出利用该新菌株发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现。

一种高产酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株MA-56的诱变、选育、鉴定及其特性：

(1)出发菌株MA的选育：

发明人从浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所实验室保藏的曲霉菌种中，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株产酸性β-甘露聚糖酶活性最高的菌株MA，并以该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株；

(2)诱变菌株MA-56的选育：