[发明专利]一种检测马凡综合症的试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种检测马凡综合症的试剂盒，其特征在于：包括特异性引物、多重PCR 反应扩增液、洁净液、单碱基延伸反应液，所述的特异性引物包括每条含18-25 个碱基的六对以上多重PCR扩增引物和与检测位点相匹配的含40-45个碱基的 突变检测引物，其中突变检测引物由5’端的地址序列和3’端的突变检测区组 成；

所述的多重PCR引物序列如下：

1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，

GACAATACACTGATTTCCGCC；

2、AAATAACTACAGATCAACTCCTGTGAG，

TTTCTGGCATAGACACTGATCG；

3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，

ATTTTAAAAACCATTACCTCTTTCAC；

4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，

CGCATTACACACGCAATGAAA；

5、TAATAAGTGCCTTTCTCTGCCA，

GGGAAGCATTCACATCTGTAG；

6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT，

TATCTCCATTGTCTCCTCGAG；

所述的突变检测引物3’端的突变检测区如下：

1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT；

2、TTTTCAAGTACAACACTGCAATATT；

3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA；

4、GAATGGCCGGATATGCAATAATGGA；

5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG；

6、TGTTTGTATATGGTAAATAGATACC；

所述的多重PCR反应扩增液由1x的多重PCR缓冲液，5mM的氯化镁溶液，75uM 的单脱氧核苷三磷酸，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的浓度均为75uM，每种多 重PCR引物各50nM，胎儿基因组DNA 2ng/5μl，金牌DNA聚合酶0.1U/μl构成， 最后用分子生物学级别的水配至5μl体系；所述的洁净液由单碱基延伸反应的 洁净酶和与其配套1x的工作液组成；所述的单碱基延伸反应液包括单碱基延伸 反应缓冲液3.76μl，5uM的突变检测引物0.06μl，2.5mM的荧光标记的双脱氧 核苷三磷酸对，其中ddATP和ddGTP；ddATP和ddCTP；ddATP和ddTTP；ddGTP和 ddCTP；ddGTP和ddTTP；ddCTP和ddTTP各0.2μl，分子生物学级别水2.96μl和 单碱基延伸反应的DNA聚合酶0.02μl；

所述的扩增后的待检测序列还需进行洁净反应，该洁净反应是将单碱基延 伸反应的洁净酶加入多重PCR的扩增产物中；

所述的单碱基延伸反应是用突变检测引物配成单碱基延伸反应液后在PCR 仪上进行，其中单碱基延伸反应液包括单碱基延伸反应缓冲液3.76μl，5uM的 突变检测引物0.06μl，2.5mM的荧光标记的双脱氧核苷三磷酸对，其中ddATP 和ddGTP；ddATP和ddCTP；ddATP和ddTTP；ddGTP和ddCTP；ddGTP和ddTTP； ddCTP和ddTTP各0.2μl，分子生物学级别水2.96μl和单碱基延伸反应的DNA 聚合酶0.02μl，最后得到15μl的单碱基延伸反应体系。

2.根据权利要求1所述的一种检测马凡综合症的试剂盒的制备方法，包括 以下步骤：

1)从有胎细胞的样品中分离胎细胞并提取胎细胞的基因组DNA；

2)设计六对以上多重PCR引物和突变检测引物；

3)先用六对以上多重PCR引物，以胎细胞DNA为模板，多重PCR扩增得到 六组以上的待检测序列，再用已设计好的突变检测引物对待检测序列进行单碱 基延伸反应，使突变检测引物的末端加入一个用于检测的荧光标记碱基；

4)将单碱基延伸反应产物杂交至芯片后，进行双通道扫描检测分析，检测 单碱基延伸反应延伸的碱基。