[发明专利]一种微生物转化制备(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法

权利要求书

1.一种微生物转化制备(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法，所述方法包括：在以1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮为底物、以热带假丝酵母(Candida tropicalis)104的发酵产物为酶源的反应体系中，于28～34℃下进行不对称还原反应，反应结束后转化液经分离纯化得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇；所述发酵产物为热带假丝酵母104经发酵获得的发酵液或湿菌体；所述热带假丝酵母(Candida tropicalis)104保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：M 209034，保藏日期：2009年2月27日；所述反应体系中还添加有终浓度10～100g/L的麦芽糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系中底物初始浓度为10～90mmol/L，发酵产物加入量以所含湿菌体的湿重计为50～400g/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应体系的溶剂为0.1M，pH 8.0的磷酸缓冲液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵产物由如下方法制备得到：热带假丝酵母104接种至发酵培养基，于温度28～34℃下培养16～30小时后，得发酵液，或者将发酵液过滤得到湿菌体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖40～60g/L，酵母粉10～15g/L，氯化铵2～5g/L，磷酸二氢钾0.5～2g/L，磷酸氢二钾0.5～2g/L，硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水，pH值6～8.5。 

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：转化液离心，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)斜面培养：适用于热带假丝酵母的斜面培养基接种热带假丝酵母104菌株，30℃斜面培养3～5天，作为斜面种子；

(2)种子培养：适用于热带假丝酵母的种子培养基接入步骤(1)制得的斜面种子，28～34℃，摇床转速100～250r/min，培养10～30小时，作为种子液；

(3)发酵培养：步骤(2)制得的种子液以5～10％体积比接种量接种至适用于热带假丝酵母的发酵培养基，28～34℃，摇床转速100～250r/min，培养16～30小时，得发酵液；

(4)微生物转化：将步骤(3)制得的发酵液离心，收集湿菌体，用0.1M，pH 8.0的磷酸盐缓冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M，pH8.0的磷酸盐缓冲液中，同时加入底物1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮，使底物浓度为10～90mmol/L，菌体浓度为50～400g/L，并添加终浓度为10～100g/L的麦芽糖作为辅助底物，于28～34℃、100～250r/min反应16～40小时；反应结束后，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)斜面培养：斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.5，121℃灭菌20分钟， 灭菌后冷却、制成斜面，接种热带假丝酵母104菌株，30℃培养3～5天，作为斜面种子；

(2)种子培养：种子培养基终浓度组成为：葡萄糖50g/L，酵母粉13g/L，NH₄Cl 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，溶剂为水，pH 6.5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却、接入步骤(1)制得的斜面种子，于28～34℃、100～250r/min培养10～30小时，作为种子液；

(3)发酵培养：发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖50g/L，酵母粉13g/L，NH₄Cl 3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，溶剂为水，pH 6.5，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，以5～10％体积比接种量接种步骤(2)制得的种子液，28～34℃、100～250r/min培养16～30小时，得发酵液；

(4)微生物转化：将步骤(3)制得的发酵液离心、收集菌体，用0.1M，pH 8.0的磷酸盐缓冲液洗涤后，将湿菌体转入0.1M，pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，同时加入底物1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙酮，使底物浓度为10～90mmol/L，菌体浓度为50～400g/L，并添加终浓度为10～100g/L的麦芽糖作为辅助底物，28～34℃、100～250r/min反应16～40小时；反应结束后，离心除去菌体，上清液用乙酸乙酯萃取，于萃取液中得到所述的(S)-1-(3，5-二三氟甲基)苯基乙醇。