[发明专利]羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料制备及蚕丝蛋白的加工利用领域，特别涉及一种骨 组织工程用羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法。

背景技术

骨损伤和骨缺损是临床上常见的疾病，常需植骨治疗，传统的治疗方法 是进行自体或异体骨移植进行骨修复。自体骨移植修复效果好，但存在供应 有限，需进行二次手术的缺点，同种异体骨移植存在免疫原性的缺点并且可 能传播传染病，都不是理想的骨修复材料。骨组织工程的基本思路是用少量 的组织细胞经体外培养扩增后修复骨缺损，同时可依据骨缺损情况任意塑形 达到完善的形态修复，为最终实现无损伤修复创伤和真正意义上的功能重建 开辟了一条新的途径。

丝素蛋白(Silk Fibroin简称SF)是一种天然结构性蛋白，由结晶区和 非结晶区两部分组成，由于其特殊的分子结构使其具有良好的生物学性质， 如生物相容性、生物降解性、抗凝血性能、力学性能、支持多种细胞的粘附、 增殖和分化等。近年来丝素蛋白在生物医用材料领域的研究和应用较多，如 细胞培养基质、药物缓释载体、固定化酶载体、隐形眼镜、人工血管和创面 膜等。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP或HA)是一种生物活性陶瓷，其化 学组成和结晶结构类似于人体骨骼中的磷灰石。HA分子中的Ca²⁺可以与含有 羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生交换反应，具有良好的骨传导性能和 生物活性，能与骨组织形成牢固的骨性结合促进骨骼生长，并且相态比较稳 定，无毒性、发炎性，是公认的性能良好的骨修复替代材料。但单一组分的 羟基磷灰石脆性大、韧性较差、力学性能不足，降解缓慢且易从植入位点迁 移，这都限制了其作为人体材料种植体的使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种羟基磷灰石/丝素蛋 白复合多孔支架材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将脱胶后的纤维状丝素在重量百分比浓度为50％的CaCl₂溶液中， 重量比为1∶25，温度98℃，时间5min，溶解后经过滤、透析后获得重量浓 度为5％丝素蛋白溶液；

(2)将60℃的饱和Ca(OH)₂溶液置于60℃水浴中，缓慢滴加10％wt的 H₃PO₄溶液，滴加过程中快速搅拌，溶液的pH保持在8.7；搅拌3h后置于 25℃静置48h，将沉淀离心，将离心所得沉淀物于超声波清洗器中振荡处理 30min，得到羟基磷灰石匀浆；

(3)在不断搅拌并保持水温为25℃条件下，根据配比需要，将丝素蛋 白溶液滴加于羟基磷灰石匀浆中，将混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处 理3～5min后取出，向其中缓慢滴加终浓度为0.03％的戊二醛交联剂并搅拌 均匀后，快速移入24孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱预冷冻12h；

(4)将冷冻12h后的载样细胞培养平板取出，在25℃条件下，回温处 理10～30min，然后重新放入-20℃冰箱再冷冻24h，然后再次取出放入-50 ℃冷冻干燥机中干燥，最终制得各种不同比例的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多 孔支架材料。

所述步骤(2)饱和Ca(OH)₂溶液和10％wt的H₃PO₄溶液的配比为体积 比700∶11。

所述步骤(2)用氨水调节pH值，使pH保持在8.7。

所述步骤(2)的滴加过程中使用磁力搅拌器快速搅拌。

所述步骤(2)的沉淀离心的离心速率为4000r/min。

所述步骤(2)得到的羟基磷灰石匀浆的钙磷比为1.67。

所述步骤(4)的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的比例为1∶9～ 7∶3。

所述的脱胶后的纤维状丝素的脱胶方法，包括以下步骤：

(1)将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成约1cm²的茧片，放入重量百分比浓度 为0.5％ Na₂CO₃沸水中进行脱胶处理，桑蚕茧层与Na₂CO₃溶液的质量比为1∶ 30。

(2)30min后，将已成纤维状的蚕茧捞出拧干，并用去离子水清洗多次， 重复上述操作2次，室温下自然晾干后得纤维状脱胶蚕丝，即脱胶后的纤维 状丝素。