[发明专利]特异性扩增hBex1基因的引物及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一对特异性扩增hBex1(Homo sapiens brain expressed，X-linked1)基因的引物及其在检测生物样品中hBex1基因的表达水平中的应用。

(二)背景技术

目前，化学药物治疗是临床治疗慢性髓系白血病细胞的主要方法，然部分患者在获得一定时间的缓解期后，由于对化疗药物产生了继发性耐药，导致病情迅速展。判断患者是否发生了继发性耐药，目前只能通过患者用药后的临床表现来评价，缺乏经济、迅速有效的检测手段。

Bex(Brain expressed，X-linked)是一类小分子信号转导中介体，目前发现5个高度同源的成员，即Bex1(TCEAL8)，Bex2，Bex3，Bex4(TCEAL7)，Bex5，一般认为Bex位于P75NTR/TrkA/B通路下游的细胞死亡前体(NADE)。Bex基因属X染色体连锁基因家族，其基因的功能目前尚未完全明了，近期的研究显示hBex1基因在获得性耐药的慢性髓系白血病细胞中表达水平明显下降。

(三)发明内容

本发明正是基于此研究发现，设计了一对可以特异性扩增hBex1基因的引物，通过PCR技术检测生物样品中hBex1基因的表达水平，以协助判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。

本发明采用的技术方案是：

特异性扩增hBex1基因的引物，序列如下：

上游序列：5′-GATCGTCTCGAGCAGGAGTAATGGAGTCCA-3′；

下游序列：5′-TCTGCTGGATCCTCAGGGCATAAGGCAAAACTC-3′。

本发明还涉及所述的引物在检测生物样品hBex1基因的表达水平中的应用，应用所述的引物通过PCR技术特异性扩增生物样品中的hBex1基因，从而检测其hBex1基因的表达水平，判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。若hBex1基因的表达水平若表达水平明显下降，则说明样本待检测生物样品的hBex1基因获得性耐药，反之没有产生耐药性。应用本发明的引物进行PCR，扩增效率高，特异性强，只扩增出一条DNA条带。因此可用于检测生物样品中hBex1基因的表达水平，协助判断慢性髓系白血病细胞是否存在获得性耐药。hBex1基因序列如SEQID NO.1所示。

具体的，所述的应用为：以待分析样品RNA反转录获得的cDNA为模板，加入所述特异性扩增hBex1基因的引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物、DNA聚合酶和Mg²⁺配成PCR反应液，进行PCR扩增反应，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得DNA片段即为hBex1基因。

所述应用的关键在于特异性引物的设计，PCR反应液中的其他组分，比如DNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物等，均可参照本领域常规组成。所述脱氧三磷酸核苷混合物通常为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1:1:1:1的混合物。

具体的，所述PCR反应液终浓度组成如下：

PCR缓冲液                                     终浓度为1×

dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)                  各100～400μmol/L

特异性扩增hBex1基因的引物                     各50～200μmol/L

模板                                          10^-3～10^-1g/L

TaqDNA聚合酶                                     1～5U/反应

Mg²⁺：                                           0.5～5mmol/L

溶剂为ddH₂O。

所述PCR扩增反应条件如下：94℃变性2分钟后，进行如下35个循环：94℃变性15S，58℃退火30S，72℃延伸30S。

PCR缓冲液终浓度为1×，是指PCR缓冲液中各组分在反应液中的终浓度与1×PCR buffer相同。10×PCR buffer组成为：100mmol/l Tris-HClpH8.3，15mmol/L KCl，0.01％(W/V)明胶，溶剂为DEPC水。