[发明专利]β-内酰胺酶检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测试剂技术领域，尤其涉及一种β-内酰胺酶检测试剂盒以及β-内酰胺酶检测方法。

背景技术

自20世纪40年代第一个β-内酰胺类抗生素——青霉素问世以来，抗生素在细菌感染性疾病的治疗中发挥了重要作用，95％以上由细菌感染引起的疾病得到控制。然而随着β-内酞胺类抗生物药物的不断开发和在临床上的广泛应用，耐药菌株越来越多，其中最主要的耐药机制是这些菌株能产生β-内酸胺酶。

研究表明β-内酰胺酶是水解β-内酰胺类抗生素分子中β-内酰胺环结构的一类酶，根据酶蛋白的氨基酸序列的同源性分为A类、B类、C类及D类，其中超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBL)是分解β-内酰胺类抗生素底物范围比以往的A类β-内酰胺酶更广的酶。β-内酞胺酶水解抗生素，使之失去抗菌活性，从而导致临床抗菌治疗失败。葡萄球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌及部分肠球菌都是由此酶表现出抗药性。

经常使用抗生素会使病原菌产生耐药性，产生耐药性的后果相当严重，抗生素失去效果。对β-内酰胺类抗生素耐药的细菌感染应用β-内酰胺类抗生素治疗，不仅得不到治疗效果，而且还成为新的耐性菌蔓延的原因，引起病人住院时间延长、费用增加和死亡率上升。因此，在确定正确的治疗方案前必须迅速且正确地检测这些病原菌是否产生β-内酰胺酶，这对于快速识别耐药菌株及控制耐药菌株传播有重要作用，也有助于相应感染性疾病的治疗和预防。

赵旺胜等于1997年报道了四种β-内酰胺酶检测方法(四种检测β-内酰胺酶方法的实验比较，南京医科大学学报(中文版)，1997年11月第17卷第6期)：(1)碘测量法：溶解青霉素G于0.1mol/L磷酸盐缓冲液中(pH6.0)，制成6000mg/L，配制1％可溶性淀粉液和2％碘溶液，测定时取0.1ml青霉素溶液与2ml待测菌液混合，置室温30分钟，加2滴淀粉溶液，再加1滴碘液混合，10分钟内能使蓝色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性株。(2)微生物法：将对青霉素敏感的指示菌接种在血平板上，平板中心贴每片1μg青霉素纸片，沿纸片周围垂直划线，接种待测菌，阳性和阴性对照菌，37℃孵育24小时，如待测菌产生β-内酰胺酶，则待测菌处的指示菌出现凹痕。(3)纸片法：取20张滤纸片(1cm×2cm)放入1ml青霉素溶液中浸湿，待纸片干后备用，用接种环挑取待检菌5～10个菌落涂于纸片上，放入带盖的平板内置37℃孵育30分钟，产β-内酰胺酶的菌株可使纸片的颜色由蓝紫色变黄。(4)酸测定法：取0.1ml青霉素酚红溶液与2ml待测菌悬液混合，10-15分钟内变为黄色为β-内酰胺酶阳性。张坚磊等1999年报道了应用碘试纸条法快速检测β-酞胺酶(陕西医学检脸，第14卷第1期1999年2月)，该法是在碘测量法的基础上建立以青霉素为底物的试纸条法，菌落涂于试纸条上，通过试纸条颜色的变化判断是否产生β-内酰胺酶。

叶枫等对四种方法检测超广谱β-内酰胺酶进行了比较(四种方法检测超广谱β-内酰胺酶的敏感性比较，《广东医学》，2004年5月第25卷第5期)，采用了纸片扩散法、双纸片协同法、Etest法和VITEK全自动细菌分析法，这些方法需要通过培养耐药菌及判断抑菌圈，实验时间长，结果易受偶然因素影响，VITEK全自动细菌分析系统及其药敏卡检测方法快速简便，但需要特殊的机器。中国专利CN200380107185.6公开了一种β-内酰胺酶检测试剂组合物、β-内酰胺酶检测试剂盒以及β-内酰胺酶检测方法，在产色头孢菌素法中使用的β-内酰胺酶检测试剂组合物含有β-内酰胺酶检测底物与β-内酰胺酶抑制剂。

以上方法是在临床细菌培养的基础上检测细菌是否产生β-内酰胺酶来判断病原菌的耐药性，适合临床上检验微生物产生的内源性β-内酰胺酶。

另一方面，β-内酰胺类抗生素由于毒性小、化疗指数高、抗菌谱广、价格便宜，在非临床领域也获得了广泛的使用，比如畜牧业就大量使用β-内酰胺类抗生素治疗奶牛乳腺炎，结果使奶源的抗生素残留问题比较严重。郑颖等研究了TEM-116型超广谱β-内酰胺酶对牛奶中抗生素的清除(《中国抗生素杂志》，2008年2月第33卷第2期)，通过试验作者发现在不太苛刻的条件下β-内酰胺酶很容易清除牛奶中残留的青霉素G。中国专利(申请号；200610051915.0)公开了一种β-内酰胺酶、其制备方法及其应用，其中也对β-内酰胺酶对牛奶中残留抗生素的去除效果进行了研究，结果也表明β-内酰胺酶在奶制品中可以分解β-内酰胺类抗生素。这些结果似乎表明β-内酰胺酶可以完全降解牛奶中残留的抗生素，减少奶业的损失，有可能成为一种新型食品添加剂。