[发明专利]半夏多倍体植株的制备方法

权利要求书

1.一种半夏多倍体植株的制备方法，其特征在于：通过悬浮培养分离制备单细胞作为多 倍体诱导的材料，包括如下步骤：

1)、将幼嫩的半夏叶片经表面消毒后切成0.4～0.6cm²的小块接种到愈伤组织诱导培养基 中进行光照培养，获得质地坚硬愈伤组织；

2)、将上述质地坚硬愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基中进行光照培养，获得质地疏 松愈伤组织；

3)、将上述质地疏松愈伤组织夹碎后接种到液体培养基中，然后置于光照条件下进行悬 浮振荡培养，获得细胞悬浮培养物；将所述细胞悬浮培养物用细胞筛过滤以除去大愈伤组织 团块，获得细胞滤液；

4)、将细胞滤液过滤、离心后，弃上清，收集细胞；然后用单细胞液体培养基悬浮上述 细胞；

5)、以步骤4)所得的悬浮单细胞为材料，用秋水仙素溶液进行多倍体诱导；所述秋水仙 素溶液中秋水仙素质量浓度为0.001％～0.01％，诱导处理时间为12h～72h；

6)、将诱导处理后的细胞溶液采用离心和洗涤的方法去除秋水仙素；

7)、将上述除去秋水仙素的单细胞用单细胞液体培养基进行光照条件下的液体浅层培养；

8)、当细胞团长到0.5～2mm时，将细胞团转接到愈伤组织诱导培养基中进行光照培养；

9)、待愈伤组织形成后转移到丛生芽培养基中进行光照培养；

10)、当所得的再生植株叶子完全展开时，转接到生根培养基中进行光照条件下的生根培 养，获得可栽培的半夏再生植株；

11)、对半夏再生植株进行染色体倍性鉴定，从上述半夏再生植株中筛选出半夏多倍体植 株。

2.根据权利要求1所述的半夏多倍体植株的制备方法，其特征是：

所述步骤1)和步骤8)中的愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤0.5～2.0 mg·L^-1+α-萘乙酸0.01～0.05mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1，pH 5.6～6.0；

步骤2)中的愈伤组织继代培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤0.1～0.5mg·L^-1+激动素 0.3～1.0mg·L^-1+2，4-二氯苯氧乙酸1.0～2.5mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1，pH 5.6～6.0；

步骤3)中的液体培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤0.1～0.5mg·L^-1+激动素0.3～1.0 mg·L^-1+2，4-二氯苯氧乙酸1.0～2.5mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1，pH 5.2～5.8；

步骤4)和步骤7)中的单细胞液体培养基均为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤0.5～2.0mg·L^-1+α-萘乙酸0.01～0.05mg·L^-1+水解酪蛋白100～400mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1，pH 5.2～5.8；

步骤9)中的丛生芽培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤0.5～2.0mg·L^-1+α-萘乙酸0.1～0.5 mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1，pH 5.6～6.0；

步骤10)中的生根培养基为：1/2MS培养基+吲哚丁酸0.1～0.5mg·L^-1+α-萘乙酸0.05～0.3 mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1+活性炭3.0～4.0g·L^-1，pH 5.6～6.0。

3.根据权利要求2所述的半夏多倍体植株的制备方法，其特征是：秋水仙素溶液中秋水 仙素质量浓度为0.003％～0.005％；诱导处理时间为24h～48h。