[发明专利]半夏多倍体植株的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种药用植物半夏多倍体诱导的方法，是利 用植物组织培养技术和细胞悬浮培养相结合进行半夏多倍体植株诱导的方法。

背景技术

半夏(Pinellia spp.)为天南星科半夏属植物，主要进行无性繁殖，干燥块茎为常见的传 统中药。现代药理学研究表明半夏具有燥湿化痰、降逆止咳、消痞散结，抗早孕、抗肿瘤 作用、降血脂，护肝和治疗冠心病等多种功效。目前野生半夏资源由于人们的盲目挖掘逐 渐减少，而人工栽培半夏遗传背景和倍性复杂多变，种质资源的不均一性限制了半夏产业 化的发展。同时，常规半夏品种对温度敏感，容易出现高温倒苗现象，影响药材产量和质 量。半夏已被国家中医药管理局列为重点推荐发展的63种紧缺中药材。

很多药用植物以根、茎、叶和块茎等器官作为收获对象，而且大部分通过营养繁殖的 药材在人工栽培过程中容易出现种质衰退以及二倍体和多倍体混杂的情况，进一步导致原 药材品质混杂。研究发现：多倍体药用植物一般具有根、茎、叶、花和果的巨型性，抗逆 性强，药用成分含量高等特性，这正是药材优质高产品种选育所期望达到的目标。因此， 应用现代生物技术手段制备多倍体药材，并通过人工筛选后扩繁有可能获得适合现代生产 技术所需要的优质药材新品种，为中药材的产业化提供技术保障。开展半夏多倍体研究， 可能从根本上解决半夏产量低、抗逆性差和有效成分含量低等问题。

虽然多倍体的一些特性对生产有利，但自然界产生多倍体的过程相当漫长，因此人们 常用人工诱导的方法来获得多倍体植株。人工诱导方法目前大致可分为物理方法、化学方 法和生物学方法，其中化学方法是最常用和最有效的方法，其诱导多倍体过程通常用秋水 仙碱、富民隆、生物碱和除草剂等化学药剂处理正在分裂的细胞以诱导染色体加倍。该类 方法诱导多倍体常用萌动的种子、幼苗、芽、愈伤组织和茎尖组织等作为秋水仙素处理材 料，处理方法有浸渍、涂抹、滴液和注射等，但是这种活体条件下的染色体加倍诱导容易 受处理材料生理条件的干扰，易产生嵌合体，并可能发生回复突变，从而增加变异植株筛 选的工作量和复杂程度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种半夏多倍体植株的制备方法，采用该方法获得的 半夏植株具有显著的多倍体特征，且筛选过程相对简便，能够确保半夏多倍体后代的纯合 率。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种半夏多倍体植株的制备方法，通过悬浮培养 分离制备单细胞作为多倍体诱导的材料，包括以下步骤：

1)、将幼嫩的半夏叶片经表面消毒后切成0.4～0.6cm²的小块接种到愈伤组织诱导培养 基中进行光照培养，获得质地坚硬愈伤组织；

2)、将质地坚硬愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基中进行光照培养，获得质地疏松 愈伤组织；

3)、将质地疏松愈伤组织夹碎后接种到液体培养基中，然后置于光照条件下进行悬浮 振荡培养，获得细胞悬浮培养物；将细胞悬浮培养物用细胞筛过滤以除去大愈伤组织团块， 获得细胞滤液；

4)、将细胞滤液过滤、离心后，弃上清，收集细胞；然后用单细胞液体培养基悬浮上 述细胞；

5)、以步骤4)所得的悬浮单细胞为材料，采用秋水仙素溶液进行多倍体诱导；

6)、将诱导处理后的细胞溶液采用离心和洗涤的方法去除秋水仙素；

7)、将上述除去秋水仙素的单细胞用单细胞液体培养基进行光照条件下的液体浅层培 养；

8)、当细胞团长到0.5～2mm时，将细胞团转接到愈伤组织诱导培养基中进行光照培养；

9)、待愈伤组织形成后转移到丛生芽培养基中进行光照培养；

10)、当所得的再生植株叶子完全展开时，转接到生根培养基中进行光照条件下的生 根培养，获得可栽培的半夏再生植株；

11)、对半夏再生植株进行染色体倍性鉴定，从上述半夏再生植株中筛选出半夏多倍体 植株。

作为本发明的半夏多倍体植株制备方法的改进：

步骤1)和步骤8)中的愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.5～2.0mg·L^-1+α-萘乙酸(NAA)0.01～0.05mg·L^-1+蔗糖25～35g·L^-1，pH 5.6～6.0；