[发明专利]草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒，其特征在于它包括：

1)内脏组织中病毒RNA提取试剂：DEPC水；蛋白酶K(1mg/mL，pH8.0)；SDS(1％)；酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70％乙醇；

2)细胞感染病毒的RNA提取试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；

3)RT反应试剂成分：5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNAsin(RI)，反转录酶AMV；

4)PCR反应试剂成分：10×PCR buffer(含mg2+)，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和Taq E(5U/uL)，所述正向引物F1：5’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’；所述反向引物R1：5’-TTGGAGACGAACATAGACGC-3

2.权利要求1所述试剂盒的应用，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：

1)肝脾肾组织中病毒RNA的提取

发病鱼的组织60-100mg加入500μL DEPC水捣碎匀浆，8,000-10,000r/m离心5-10min，取上清，加40μL蛋白酶K和40μL1％SDS，37℃孵育30min；再加入600μL酚/氯仿/异戊醇((25/24/1))，充分混匀30S，10,000-12,000r/m离心5-10min，取上层水相；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1))混合液，充分混匀30S，10,000-12,000r/m离心5-10min取上层水相；加入等体积的异丙醇，混匀后室温沉淀15-20min，沉淀核酸，12,000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。

(2)草鱼肾细胞(CIK)感染病毒的RNA的提取

染毒的CIK细胞液反复冻融三次，取250μL病毒悬液，加750μL Trizol高速混匀，室温3-5min，再加200μL氯仿剧烈摇晃，室温3-5min；12,000r/m离心10-15min，吸上清450-500μL，再加入等体积异丙醇，室温沉淀15-20min，12,000r/m离心10-15min，70％乙醇洗涤，吹干，加入适量DEPC水溶解，备用。

(3)RT-PCR扩增

RT反应：反应体系共25μL

RNA模板        13.5μL

Rnasin(RI)     0.5μL(20U)

所述反向引物R1    1μL(120nmol/L)

置于72℃水浴中作用10min，冰浴5min。

然后依次加入

5×AMV Buffer    5.0μL

dNTP             4μL(每种dNTP溶液浓度均为2.5mmol/L)

AMV反转录酶      1μL(5U)

置于42℃水浴中作用1h，再95℃作用5min灭活AMV。

PCR反应：反应体系为50μL

反转录模板        1.0μL

10×PCR Buffer    5.0μL(含Mg²⁺)

dNTP              4μL(浓度同上)

Taq E             0.25μL(1.25U)

所述正向引物F1    1μL

所述反向引物R1    1μL

DEPC-H2O          37.75μL

PCR扩增程序

(1)95℃    3min

(2)94℃    50s

(3)52℃    50s

(4)72℃    50s

(5)回到第2步，重复30次

(6)72℃    7min

(7)4℃     5min

(4)电泳、PCR产物结果判定

取PCR产物5μL，制备1％琼脂糖凝胶直接进行电泳，用溴化乙锭染色。在紫外成像系统中观察结果，与DL2000标准分子量对照，若在与阳性对照同一位置的436bp处出现明亮的反应条带，则为GCRV阳性，说明待测样品携带GCRV，否则为阴性。