[发明专利]草鱼呼肠孤病毒基因诊断试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉水生动物病毒的诊断试剂盒及其应用，主要是针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV，Grass carp reovirus)第六基因片段保守部分的诊断试剂盒及检测方法。

背景技术

草鱼出血病病毒(Grass Carp Hemorrhage Virus，GCHV)，属于水生呼肠孤病毒，病毒颗粒为二十面体对称的球形颗粒，其成熟病毒直径为75nm，具有双层衣壳，无囊膜，其基因组由11条dsRNA组成，在pH3-11范围内十分稳定，对氯仿和乙醚有抗性。国际病毒分类委员会第五次会议决定在呼肠孤病毒科中正式新建水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus，ARV)，并将草鱼出血病病毒纳入该属，命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)，但有别于其它六个亚型(A-F)的水生呼肠孤病毒的代表种，而单独列为第七个亚型(G)的代表种。GCRV是我国分离的第一种鱼类病毒，也是中国在国际上首次完成全基因序列分析的第一株水生呼肠孤病毒，并且各基因序列已登录GenBank。该病毒是水生呼肠孤病毒属中毒力最强的病毒，能引起草鱼出血病的流行。该病流行于我国各地养殖区，尤以长江流域和广东、广西、福建最为普遍，流行季节在每年5月初和10底之间，水温在20℃开始流行，最适流行水温为27℃-30℃，死亡率可达50％-80％。每年造成数万吨鱼产量损失，严重影响我国草鱼养殖业的发展。目前对于草鱼病毒病还未有特效的治疗方法，推行草鱼的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。早期快速诊断草鱼呼肠孤病毒是目前草鱼养殖所采取的主要预防措施的前提，也是减少草鱼损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大草鱼养殖者急切盼望的。多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。虽然关于GCRV RT-PCR方法也有文献报道，但只有用于设计引物的原株病毒为PCR阳性，扩增不出其它GCRV的相应片段，本试验根据GenBank已发表的GCRV及其它水生呼肠孤病毒的第六基因片段，在保守区设计了一对GCRV特异性引物，建立了GCRV快速诊断方法，在国内外尚无报道。该方法的建立为草鱼呼肠孤病毒的快速诊断和病原调查提供技术支撑。

发明内容

本发明目的是利用GCRV基因保守区序列设计一对引物，建立GCRVRT-PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供草鱼呼肠孤病毒的快速基因诊断试剂盒和检测方法。该试剂盒操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于草鱼出血病的快速检测及草鱼鱼种和草鱼养殖过程中的GCRV的跟踪检测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率；也可用于草鱼肾细胞系(CIK)分离病毒的鉴定，为病毒的进一步研究奠定基础，具有很高的实用价值。

本发明提供的草鱼呼肠孤病毒的基因诊断试剂盒包括：

1)内脏组织中病毒RNA提取试剂：DEPC水；蛋白酶K(1mg/mL，pH8.0)；SDS(1％)；酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)；氯仿/异戊醇(24/1)；异丙醇；70％乙醇；

2)细胞感染病毒的RNA提取试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；70％乙醇；DEPC水；

3)RT反应试剂成分：5×AMV Buffer，dNTP，DEPC水，，反向引物R1，RNA酶抑制剂RNAsin(RI)，反转录酶AMV；

4)PCR反应试剂成分：10×PCR buffer(含mg2+)，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)；特异性寡核苷酸引物F1和引物R1；DEPC水和Taq E(5U/uL)，

5)所述的特异性寡核苷酸引物F1和R1：是根据GCRV第六基因片段保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：

正向引物F1：5’-ATCCCGTATATCTATGGCTT-3’

反向引物R1：5’-TTGGAGACGAACATAGACGC-3

使用草鱼呼肠孤病毒(GCRV)基因诊断试剂盒检测方法程序如下：

(1)肝脾肾组织中病毒RNA的提取