[发明专利]胰岛素样分泌细胞的制备法及所用的组合培养基

说明书

技术领域

本发明属于生物和医药技术领域，特别是一种利用成人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)来制备胰岛素样分泌细胞的方法及所用的组合培养基。

背景技术

随着生活水平的提高，糖尿病已成为威胁全人类健康、生命的重大社会问题，给社会造成巨大的经济负担。而胰岛移植被认为是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病的最有效手段，然而，由于供体胰腺的严重缺乏，限制了胰岛移植的广泛临床开展。异体移植由于具有严重的免疫排斥问题，无法真正用于临床实施。近年来，干细胞技术的发展及干细胞胰岛分化技术的调控，成为解决胰岛移植供体紧缺难题的新希望。

小鼠及人的胚胎干细胞已有报道可以被诱导分化为能分泌胰岛素的细胞，但胚胎干细胞存在伦理学限制，同时资源有限，且移植后仍存在异体移植免疫排斥。hBM-MSCs具有多向分化潜能，可向内、中、外三胚层细胞分化，且来源取材方便，资源丰富，并可以实现自体移植，是糖尿病β细胞替代治疗的理想种子细胞。通过体外、体内移植功能等多方面监测、评价其诱导效率，建立有效的体外诱导调控的方法，促进hBM-MSC分化为具有纠正糖尿病高血糖状态的胰岛素样分泌细胞，是促进胰岛移植发展迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种胰岛素样分泌细胞的制备法及所用的组合培养基，采用本发明的方法能将hBM-MSCs分化成胰岛素样分泌细胞。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种制备胰岛素样分泌细胞用的组合培养基，由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成；

培养基I为：DMEM高糖培养基，1-2％FBS(胎牛血清)，9-11ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，1％DMSO(二甲基亚砜)，17-25mmol/l葡萄糖；

培养基II为：无血清DMEM/F12培养基，15-19mmol/l葡萄糖，9-11mmol/l尼克酰胺，18-22ng/ml EGF(表皮生长因子)，18-22ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，10nmol/l exendin-4，1％B27添加剂和1％N2添加剂；

培养基III为：RPMI 1640培养基，10-12mmol/l葡萄糖，9-11mmol/l尼克酰胺，9-11mmol/l Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，90-110pmol/l HGF(肝细胞生长因子)，1.5-2.5nmol/l activin-A(激活素A)，9-11nmol/l exendin-4。

本发明还同时提供了利用上述组合培养基进行的胰岛素样分泌细胞制备法，采用3-5代hBM-MSCs，包括以下步骤：

1)、以培养基I重悬3-5代hBM-MSCs，然后以2-3×10⁴个细胞/cm²密度接种于6孔板，于37℃、5％CO₂的环境，接种时间为65～80小时；

2)、将上述接种后所得的细胞用PBS(磷酸缓冲液)洗涤，将洗涤后的细胞放入培养基II中于37℃、5％CO₂环境下孵育140～160小时；

3)、去除步骤2)所得物中的培养基II，然后加入培养基III，于37℃、5％CO₂环境孵育110～130小时，得胰岛素样分泌细胞。

可以采用DTZ染色来鉴定分化后细胞胰岛样分泌细胞形成的效率，采用该方法检测后的细胞仍能用于后续的移植。

在本发明中，

培养基I的制备方法如下：在100ml的DMEM高糖培养基中加入1-2ml的FBS、900-1100ng的bFGF、1ml的DMSO和1.7-2.5mmol葡萄糖混合而成。

培养基II的制备方法如下：在100ml的无血清DMEM/F12培养基中加入1.5-1.9mmol的葡萄糖、0.9-1.1mmol的尼克酰胺、1800-2200ng的EGF、1800-2200ng的bFGF、1nmol的exendin-4、1ml的B27添加剂和1ml的N2添加剂。

培养基III的制备方法如下：在100ml的RPMI 1640培养基中加入1.0-1.2mmol的葡萄糖、0.9-1.1mmol的尼克酰胺、0.9-1.1mmol的Hepes、9-11pmol的HGF、0.15-0.25nmol的activin-A和0.9-1.1nmol的exendin-4。