[发明专利]一种乙酸萘酯酶的净化方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种乙酸萘酯酶的净化方法，尤其是一种可用于有机磷农药快速测定的乙酸萘酯酶的净化方法。

(二)背景技术

测定有机磷农药残留的方法主要有色谱法和酶抑制法，色谱法虽然可靠，但耗时、成本高，需要受过专门训练的技术人员操作，只适合在实验室检测，不适合在现场检测。在用酶抑制法快速测定有机磷农药中常用的酶为乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶从动物血液或组织中提取。虽然动物乙酰胆碱酯酶比较灵敏，但容易失活，价格昂贵，且操作需要一定的技术，熟练掌握有一定的难度，不太适合在蔬菜基地快速检测使用和大面积推广使用。现有公开的测定果蔬中有机磷农药残留的植物源性酯酶(在目前公开的资料中将这类酶称为植物酯酶，根据酶学分类和命名，这种命名方法不够确切。本方法中根据该酯酶催化的底物(乙酸萘酯)和酶学分类、命名原则，将该酯酶命名为乙酸萘酯酶)的提取方法，由于酶源的处理、提取液的选择、酶源浸泡时间以及酶源质量与提取液比例的选择等条件优化不足的原因，所提取出的酶对有机磷农药的最低检出限较高。申请人在之前的申请200710071204.4中公开了一种乙酸萘酯酶的提取方法，以蒸馏水为提取液，从含有乙酸萘酯酶的种子中提取得到酯酶粗提液，然后经硫酸铵分段盐析，所得酶液经透析除盐，再将透析后的酶液浓缩、冷冻干燥得到乙酸萘酯酶。该方法能够制得对有机磷农药敏感、对农药的最低检出限较低的酯酶。

所述乙酸萘酯酶可催化下列反应：

α-萘酚+固蓝盐B →显色产物+氯化锌+氯化氢

但是，200710071204.4中公开的乙酸萘酯酶的提取方法，所提取出的酶对有机磷农药的最低检出限仍然较高。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能用于快速测定果蔬中有机磷农药残留的乙酸萘酯酶的净化方法，以提高酶的活性，降低最低检出限，提高检测灵敏度，使有机磷农药残留的现场快速测定更加可靠。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种乙酸萘酯酶的净化方法，以蒸馏水为提取剂提取得到的乙酸萘酯酶粗提液先经过硫酸铵分段盐析，然后透析除盐，所得酶液进行净化，所述净化方法如下：以0.15～0.25mol/L NaCl溶液为洗脱液，使所得酶液过Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，收集含有乙酸萘酯酶的洗脱液，冷冻干燥即得乙酸萘酯酶。

本发明采用凝胶柱层析，通常先取酶液样品进行洗脱试验，以获知乙酸萘酯酶被洗脱下来的时间段，然后剩余酶液采用同样洗脱条件进行洗脱，收集该时间段内的洗脱液，即为含有乙酸萘酯酶的洗脱液，经后处理即可得到乙酸萘酯酶。

本发明所述的净化方法具体推荐按照如下步骤进行：

(1)取酶液，以0.15～0.25mol/L NaCl溶液为洗脱液，使酶液过Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，按照时间梯度分别收集洗脱液，检测各时段洗脱液的乙酸萘酯酶含量，获得洗脱液中乙酸萘酯酶含量与保留时间的关系图，记录出现分离峰的时间段；

(2)然后将剩余酶液按照步骤(1)所述方法进行洗脱，收集出现分离峰的时间段内的洗脱液，所得洗脱液经冷冻干燥得到乙酸萘酯酶。

本发明制得的乙酸萘酯酶一般置于4℃冰箱保存。使用前取出，待酶温恢复至室温后，用pH6.38的磷酸缓冲液配制成5U/mg的酶液。

本发明使用的Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱可采用常规方法进行制备，包括凝胶处理、装柱、平衡、加样、洗脱、收集等步骤。

其中凝胶处理步骤，通常先根据层析住的体积和所选用的凝胶溶胀后的床体积，计算所需溶胶干粉的质量，将称好的Sephadex G-100干粉置于过量蒸馏水中，使之充分吸水溶胀，然后通过抽滤等方法排出凝胶内部的气泡。装柱时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则会出现断层。凝胶沉积后，要用平衡液平衡层析柱，一般平衡液为有一定的pH和离子强度的缓冲液(比如磷酸缓冲液)，用恒流泵在恒定压力下走柱子，压力通常与洗脱时的压力一致，当下出口流出液的pH值与平衡液的pH值一致时，层析柱即达到了平衡。本发明在洗脱时采用恒流泵在恒定压力下走柱子，保持不同次洗脱在同样的洗脱条件下进行。

与现有技术相比，本方法提供的净化方法采用了凝胶柱层析法，通过对凝胶柱和洗脱液的筛选，使得通过净化能够提高酶的活力近10倍，能够使最低检出限降低近10倍，大大提高了检测灵敏度，使有机磷农药残留的现场快速测定更加可靠。

(四)附图说明

图1为本发明制得的蛋白质含量标准曲线图；