[发明专利]CD19单克隆抗体免疫脂质体的制备及用途

权利要求书

1.一种CD19单克隆抗体免疫脂质体，通过以下步骤制备：

(1)CD19单克隆抗体ZCH-4-2E8的制备：基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤 经典方法制备，所述单抗重链可变区基因编码的氨基酸如SEQ ID NO 3所示，所述单抗轻 链可变区基因编码的氨基酸如SEQ ID NO 4所示；

(2)2E8修饰的立体空间稳定去甲斑蝥素脂质体2E8-SL-NCTD的制备：

首先采用薄膜分散法，制备立体空间稳定性去甲斑蝥素脂质体，将大豆卵磷脂、胆固 醇，甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺按2∶1∶0.01的摩尔比溶于氯仿中，减压旋转蒸发 去除有机溶剂，然后在含有去甲斑蝥素脂质体的HBS缓冲液中水化，形成脂质体混悬液，此 脂质体混悬液通过孔径为1.2，0.4，0.1微米的聚碳酸脂膜整粒10次，分别取NCTD，空白脂 质体和NCTD脂质体混悬液1ml，过SephadexG-50，流速1ml/min，每分钟收集一份洗脱液， 共收集25份，分光光度法测量NCTD在213nm处的吸光值，以吸光值对洗脱体积作流出曲线；

(3)胶束准备：取甲氧基-聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺-聚乙二醇2000- 二硬脂酸磷脂酰乙醇胺，按4∶1摩尔比溶于氯仿中，减压旋转蒸发去除有机溶剂并真空过夜 干燥，而后在HBS缓冲液中水化1小时；

(4)2E8与胶束连接：取10mg/ml 2E8单抗与2-亚氨基硫烷盐酸盐试剂按1∶50摩尔比 反应，通过Sephadex G-50，以HBS缓冲液为洗脱液去除未反应的2-亚氨基硫烷盐酸盐试 剂，然后，以浓度180ug 2E8/umol PC与步骤(3)胶束在HBS缓冲液中，4℃孵育反应过 夜；

(5)2E8单抗从胶束转移至脂质体：将所获得的抗体与胶束的混悬液通过0.22um的微 孔滤膜以去除未连接单抗的胶束和自身发生聚集的胶束，过滤后的悬液与先前制备的 SL-NCTD，按磷脂摩尔比0.05∶1，60℃敷育1小时，待其冷却后，过Sepharose CL-4B色谱 柱，以HBS缓冲液平衡并洗脱柱子，去除未转移的2E8单抗，Sepharose CL-4B湿装柱的直 径1.5cm，柱床体积44ml，分别取0.5ml游离2E8与0.5ml SL-NCTD，经Sepharose CL-4B， 以HBS缓冲液洗脱，流速1ml/min，每2ml收集一份洗脱液，在213nm处收集获得目的物。

2.根据权利要求1所述的一种CD19单克隆抗体免疫脂质体在制备特异性靶向杀伤B 淋巴细胞白血病及其干细胞药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述B淋巴细胞为白血病细胞株Nalm-6 细胞、B细胞系淋巴瘤细胞Raji细胞。