[发明专利]从非变性聚丙烯酰胺胶中回收和纯化DNA片段的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收和纯化目标DNA片段的方法。 

背景技术

在分子生物学研究中，常常需要对目标DNA片段进行回收和纯化，其主要目的是排除非目标DNA片段。常见的情况有两种，其一是，DNA扩增反应中往往存在非特异性扩增或多位点扩增，产物中一般会出现一些非目标片段；其二是，对载体及目的DNA片断酶切后，产物中往往含有目标片段外的多余片断。因此，在应用目标片段进行进一步实验前，必须对其进行回收和纯化。最常用的方法是，应用凝胶电泳分离DNA样品，显色后切取目标条带，释放DNA，通过酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收。 

应用凝胶电泳回收DNA片段，可采用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，其中，基于琼脂糖凝胶的回收和纯化方法较多且较成熟，但琼脂糖凝胶电泳的分辨率较低，一般只适用于分离0.5~25kb的DNA片段；对于分子量较小的DNA片段，需要采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳。两种方法的基本差异表现在切下目标条带后DNA的释放，其后可采用相同的步骤，而DNA从凝胶中的释放，正是应用PAGE回收DNA的主要难点。 

DNA难以从PAGE胶中释放出来，是由丙烯酰胺的一些特性造成的。无论是采用变性PAGE胶，还是非变性PAGE胶，丙烯酰胺以C-C键聚合，聚合后很难解聚，在高温下又不会像琼脂糖一样熔化；同时，在常规实验中，PAGE胶浓度一般为6-10％，其分子结构非常紧密，不利于DNA释放。目前通常的做法是，采用无菌枪头将切取的PAGE胶捣碎，放置在低温环境中过夜浸泡，收集上清液，用冰乙醇沉淀纯化。但是，用无菌枪头捣碎胶，既费时，胶的破碎度也不够，导致DNA释放量低；为了提高胶的回收率，需要浸泡过夜，会导致DNA的降解。 

本发明克服了以往方法中碎胶程度不够、操作步骤繁琐，实验过程耗时长、回收量低的缺点，能够在2小时内从银染后的非变性PAGE胶中获得纯化后的目标DNA片段，且成本低、质量高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种从非变性PAGE胶中回收和纯化目标DNA片段的有效方法。 

本发明是通过如下技术方案来实现的： 

1.样品清洗：从染色显带后的非变性PAGE胶中切下目标DNA片段，置于称量皿中，加入双蒸水ddH₂O洗涤。 

2.样品研磨：将洗涤后的胶条移入无菌离心管，利用组织研磨仪将其充分打碎。 

3.样品浸泡：加入分散缓冲液[0.5M醋酸铵，0.01M醋酸镁，1mM EDTA(pH8.0)，0.1％SDS]，混匀，60℃温浴1小时。 

4.凝胶去除：加入与上述分散缓冲液等体积的氯仿抽提液，离心，吸取上清液，移入新的无菌离心管中。 

5.乙醇沉淀：加入上述上清液2倍体积的冰乙醇，混匀，静置10分钟，离心，弃上清液，经75％乙醇清洗后，倒置干燥。 

6.DNA溶解：加入1×TE缓冲液，溶解，取微量样品检测其质量，其余样品保存于-20℃待用。 

本发明利用组织研磨仪充分打碎含目标DNA片段的胶条、通过分散缓冲液浸泡碎胶，氯仿抽提上清液和酒精沉淀DNA溶液，达到快速、高效回收和纯化目标DNA片段的目的。采用本发明，可在2小时内从银染后的非变性PAGE胶中获得纯化后的目标DNA片段。 

附图说明

图1A为水稻微卫星标记RM19座位上7个等位基因的普通模版扩增检测结果； 

图1B为水稻微卫星标记RM19座位上7个等位基因的回收纯化后重新扩增检测结果。 

具体实施方式

如图1A、图1B，图中M：分子量标记；1、2、3、4、5、6、7分别表示7 个不同的等位基因。 

实施例：水稻微卫星标记RM19的7个等位基因DNA片段的回收与纯化。 

水稻微卫星标记RM19曾在我国主栽水稻亲本中检测到7个不同的等位基因，但存在明显的非特异片段(图1A)。根据上述发明技术、采用下述步骤对各个片段进行了纯化。 

1.聚合酶链式反应(PCR)扩增 

采用50μl反应体系，每个等位基因扩增5份，扩增反应在PCR仪上进行。