[发明专利]高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术医学及生活领域，尤其涉及一种高产聚-β-羟丁酸(PHB)的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Bm-10菌株及其用途。

背景技术

聚-β-羟丁酸(PHB)是细胞内的一类生物聚酯，其力学性质与一些热塑性材料如聚丙烯相似，并且可以被微生物完全降解，因而被称之为“生物可降解塑料”，是真正的环境友好型产品。研究生物可降解塑料来替代化学合成塑料可以帮助我们解决塑料污染问题，节约能源，实现资源与环境的可持续发展。PHB是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物(分子量50000～1000000)。作为微生物合成的可降解材料，PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质，还具有一般化学合成高分子所没有的性质如光学活性、低透氧性、抗紫外辐射、生物可降解性、生物相容性、压电性和抗凝血性等，在工业、农业、环保、食品、医药等领域具有十分广阔的应用前景。如在医疗领域，PHB可以作为药物基质植入人体，以控制药物的释放，且最终降解产物为β-羟基丁酸，没有任何毒副作用。

自发现生物体内可以积累PHB以来，国内外许多研究者致力于PHB的研究。英国、日本、加拿大、美国等已实现了PHB的工业化生产。国内PHB的研究起步较晚，但也取得了一定的成果。中科院微生物所、山东大学、清华大学等在PHB的研究方面已经取得了一些研究成果和进展。但总的来说相对于化学合成塑料，PHB的生产成本仍然较高，约为传统塑料生产成本的数倍至十几倍。

发明内容

本发明针对市场上对可降解塑料需求的日益增长，而现有技术中利用微生物法生产可降解塑料菌种产量低、成本高等问题。本发明的一个目的是提供高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株，该菌株从污泥中筛选获得，可用于PHB的微生物制备。本发明另外的一个目的是提供上述的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株的用途。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株，高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株的保藏号为：CCTCC NO：M209131，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2009年6月25日，分类命名为：巨大芽孢杆菌Bm-10 Bacillus megaterium Bm-10。该菌株菌落乳白色不透明，圆形，较大、直径约3～6mm，表面光滑，边缘整齐，无特殊气味。显微镜观察细胞呈杆状或近椭圆形杆状，粗大，长度约3～5μm，宽度约1.2～1.5μm；趋于扭曲的短链；周生鞭毛，具运动性；革兰氏染色阳性。16S rDNA电泳和测序分析结果表明，其长度为1513bp，与巨大芽孢杆菌(B.megaterium)菌株的同源性达99.7％。鉴定该菌株为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。对该菌体内的PHB通过苏丹黑染色进行初步定性定量测定，细胞内含量较多。

上述的高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株的筛选方法如下：取0.2g土壤，加入5mL蒸馏水，85℃加热15min，进行10^-1～10^-4梯度稀释，选择10^-2浓度100μL涂布牛肉膏蛋白胨培养基平板，30℃培养24h，出现圆形乳白色菌落；挑取单菌落，进一步分离、纯化后，获得菌株。

作为优选，所述的牛肉膏蛋白胨培养基的配方包括牛肉膏20g、蛋白胨5g、氯化钠5g、水1L，pH 7.2。

为实现上述的第二个目的，本发明的高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株用于聚-β-羟丁酸的制备。

高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株用于聚-β-羟丁酸的制备方法，该方法包括以下的步骤：

①挑取适量菌种接入牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃活化培养20～30h；装入牛肉膏蛋白胨培养液，取培养的种子培养液，按4～10％的接种量接种后，30℃，200r/min，摇瓶培养80～120h，可得PHB含量占菌体干重的45％～55％的巨大芽孢杆菌菌体；

②将摇瓶所得培养液10000r/min离心5min，收集菌体，无菌水洗涤3次后再用丙酮洗涤一次，之后加氯仿与酒精的混合液提取PHB，然后40℃干燥后可得到白色沉淀即为PHB。

本发明由于采用了上述的技术方案，从污泥中筛选获得高产聚-β-羟丁酸的巨大芽孢杆菌Bm-10菌株，该菌株可用于PHB的微生物制备，解决了现有技术中利用微生物法生产可降解塑料菌种产量低、成本高等问题。

附图说明