[发明专利]人α防御素5活性肽的基因工程制备方法

权利要求书

1.一种人α防御素5活性肽的基因工程制备方法，其特征在于包括步骤：

1)目的基因的获取：设计合成寡核苷酸引物SEQ ID NO：7-9并重叠延伸 扩增出SEQ ID NO：2所示序列的DNA；

2)将步骤1)所得目的基因，与线性化pPIC9K共转化，通过Red/ET同源 重组构建重组表达质粒；

3)将步骤2)所得重组表达质粒转化入酵母细胞中，筛选出基因组中整合 有多拷贝目的基因的酵母克隆株，所述酵母为毕赤巴斯德酵母菌株GS115；

4)高密度培养步骤3)所筛选的酵母克隆株，并用甲醇诱导目的基因的高 效表达；

5)从步骤4)所获得的发酵上清中分离纯化人α防御素5活性肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)包括采用限制性内切酶 Sac I酶切步骤2)所述重组表达质粒，获得具有可发生多次单交换同源重组以 致于多拷贝目的基因整合入酵母细胞基因组的游离AOX1 5’端的线型化重组表 达质粒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3)包括采用两次电击转化 方法将线型化重组表达质粒转化入酵母细胞中，再利用G418抗性表型和组氨酸 合成能力与甲醇利用能力表型筛选获得基因组中整合有多拷贝目的基因的酵母 克隆株。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)包括采用生物发酵罐高 密度培养权利要求3所述的酵母克隆株和用甲醇诱导目的肽的表达，采用高效 液相色谱层析法连续监测目的肽的含量，以获得高效表达目的肽的发酵上清。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤4)中采用生物发酵罐时， 发酵温度控制在28～30℃，溶解氧含量控制在30％～40％之间，pH值控制在3.5～ 5.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5)包括采用捕获纯化、组 分分离纯化和精纯化3个步骤从权利要求4所述的发酵上清中纯化获得人α防 御素5活性肽；所述捕获纯化步骤包括应用超速离心沉淀分离法、连续超滤更 换缓冲溶液法；所述组分分离纯化步骤包括应用阳离子交换层析；所述精纯化 步骤包括应用反相层析法。