[发明专利]人α防御素5活性肽的基因工程制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程制药领域，具体涉及一种具有杀灭细菌和抗病毒生物活性多肽-人α防御素5活性肽的基因工程制备方法。 

背景技术

当前细菌和病毒感染仍然是人类生命和健康的主要威胁。自上世纪早期青霉素和磺胺药问世以来，人类已发明了近百种主要以干扰细菌的核酸或蛋白质的代谢与合成或抑制细菌胞壁合成的机理达到抗细菌目的的抗菌素，然而由于这些传统抗生素的作用机制容易诱导细菌发生突变而产生耐药性。临床实践中已发现针对传统抗生素的多种耐药菌株，使得人类再次面临致病细菌的挑战。因此，人们一直在努力寻求与开发新型的抗菌素。另一方面，自从首例艾滋病病例的出现以来，又有SARS病毒、流感病毒、肝炎病毒、登革热病毒等病毒所致疾病的暴发与流行，使得人类的生命时常面临危机。由于病毒的基因很容易发生突变，病毒所致的损伤往往有宿主免疫系统的功能失误参与，至今人们尚未寻找到可长期使用且具有特效抗病毒的药物。因此除应用目前通过抑制病毒核酸或蛋白酶，或利用免疫因子杀伤病毒，或利用病毒疫苗免疫人体等机理生产的药物外，还必须寻找其他更为高效低毒的抗病毒药物。 

经过近二十年的研究，发现在植物、昆虫和包括人在内的高等动物机体内存在近千种内源性阳离子肽------防御素(Defensin)(Shalin Seebah et al，Nucleic Acids Research，2007，35：262-268)。具有活性的防御素分子一般为3-6kD的非糖基化多肽，多数分子内存在6～8个保守半胱氨酸残基形成的3～4对链内二硫键外，还富含精氨酸、脯氨酸等特殊残基，整个分子在中性溶液中带正电荷；晶体衍射揭示防御素分子具有α螺旋、β折叠、二硫键桥、无规卷 曲等单种或多种二级结构所形成的单体或多聚体空间结构。根据二硫键等结构的组成方式，防御素被分为α、β和θ等类型。研究已证实，有805种防御素具有快速、强效地杀灭多种细菌的活性；有261种防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋体的作用；有48种防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有54种防御素可产生抗癌细胞的生物效应。此外，防御素作为机体免疫系统的重要组成部分，参与了免疫调节等多种生物学功能。研究显示防御素的抗微生物活性与其结构相关，通过其所具有的净电荷、疏水性与亲水性、空间构象与极向角等因素构成的特征性机理杀伤细菌(Michiael R.et al，Pharmacol Rev，2003，55：27-55)，因此防御素直接扰乱细菌胞膜的结构进而破坏胞膜的通透性和细胞能量状态，导致细胞膜去极化、呼吸作用受抑制，以及细胞ATP含量下降，最终致靶细菌死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒衣壳中的靶分子结合而导致病毒失去感染宿主细胞的生物活性(E Hazrati et al，J Immunol，2006，177：8659-8666)。由于这些特殊的作用机理，使防御素具备两个特点：一是抗微生物谱广，二是靶微生物难以对其产生抗性突变。因此，生物学家认为防御素可能成为一种新型的抗生素，在作为抗感染制剂、食品防腐剂等方面具有广阔的应用前景。 

迄今为止，相继发现了6种人α-防御素(HNP1-4，HD5，HD6)和6种人β-防御素(HBD1-6)。人α防御素5活性肽是分子量为3.58KD的阳离子短肽，含保守的6个半胱氨酸残基，构成3个分子内二硫键，形成由3条稳定的β-折叠片构成的两歧性分子。研究发现，HD5除在人肠道潘氏细胞中大量分泌表达外；在生殖道上皮细胞、鼻粘膜和部分正常支气管粘膜等细胞中存在固有表达，还可因炎症、感染和细胞恶性转变等因素的刺激而表达、分泌上调。研究表明，化学合成、从粘膜组织中提取和转基因小鼠表达的HD5不仅具有高效而广谱的抑菌和参与免疫保护调节的活性，而且具有阻止HIV、HSV等病毒粘附进入细胞和抑制病毒颗粒复制的抗病毒作用(N.H.Salzman et al，Nature，2003，422：522-526；Bryan Ericksen et al，Antimicrobial Agent andChemotherapy，2005：269-275；C.B.Buck et al，Proc Natl Acad Sci，2006，103：1516-1521)。由此可见，HD5在消化道、生殖道等粘膜内源性感染预防和免疫保护调节中发挥着重要作用。另一方面，HD5是机体与病原微生物相互 作用过程的进化产物，其具有特异识别与杀伤病原微生物的活性，理论上对人体不会产生免疫抗体等毒副效应，因此HD5是具有良好开发前景的新型抗病原微生物的药物候选分子。