[发明专利]采用微不定芽技术快速繁殖转基因半夏的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，具体是一种采用微不定芽技术快速繁殖转 基因半夏的方法。

背景技术

半夏(Pinellia ternate(Thunb)Berit(Araceae))是天南星科半夏属多年生植物，主要分布于 中国华东、华北以及长江流域。块茎含挥发油、少量脂肪(其脂肪酸约34％为固体酸、66％ 为液体酸)、淀粉、烟碱、粘液质、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、β-氨基丁酸等氨基酸、 β-谷甾醇、胆碱、β-谷甾醇-β-D-葡萄糖甙、3，4-二羟基苯甲醛，又含药理作用与毒芹碱及 烟碱相似的生物碱、类似原白头翁素刺激皮肤的物质。嫩芽含尿黑酸及其甙。半夏以块茎 入药，具有燥热化痰，降逆止呕，消痞散节的功效，为中国传统常用药材。近年来又发现 其具有抗肿瘤，抗早孕、护肝、降血脂的作用。半夏在传统中药196个处方中出现频率居 于第22位，应用十分广泛，具有重要药用价值，社会需求量也很大。

半夏喜生长溪水旁、田间、灌木丛等阴湿的环境下，分块茎繁殖、珠芽繁殖、种子繁 殖，但主要靠珠芽、块茎行无性繁殖，繁殖系数较低，繁殖周期较长。

近年来由于对半夏需求的不断增长，人们大量采挖，其野生资源急剧减少；另一方面 由于种源缺乏、种质退化及病虫害等原因制约其种植的规模化，导致半夏资源的严重匮乏， 成为以半夏为原料的医药产品发展的瓶颈。随着生物技术的发展，植物组织培养技术日臻 成熟，目前已在多种园林、园艺及药用植物上取得应用。由于半夏本身较高的市场价值， 科研人员针对其快速繁殖与培养体系的建立方面展开了大量研究，并取得一系列成果。

现有文献中目前已有多种植物通过微不定芽技术快速繁殖成完整再生植株的报道。如 果能通过微不定芽技术快速繁殖转基因半夏，将对保持转基因半夏的遗传稳定性，对转基 因半夏的大面积推广、保障充足优质的半夏种苗、提高产量、缩短繁殖周期具有重要意义。 但是现有有报道的植物的微不定芽快速繁殖技术中，它们所选取的生芽培养基、微不定芽 诱导培养基、不定芽生根培养基和移栽基质均不适合于转基因半夏的快速繁殖，目前也尚 未发现与本发明主题所提及的采用微不定芽技术快速繁殖转基因半夏的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用微不定芽技术快速繁殖转基 因半夏的方法。本发明中涉及半夏生芽培养基、微不定芽诱导培养基、不定芽生根培养基 和移栽基质用于本发明微不定芽组织培养的方法，建立了用微不定芽技术快速繁殖转基因 半夏的方法，能够在短时间内繁殖出大量的转基因半夏苗，为转基因半夏的大面积推广、 保障充足优质的半夏种苗、提高半夏产量、缩短繁殖周期奠定了坚实的基础。

发明是通过以下技术方案实现的：本发明将转基因半夏外植体经过消毒后，置于生芽 培养基上，光照培养，生成叶片和叶柄；待顶芽长到4cm-6cm时，切下叶片和叶柄，置于 微不定芽诱导培养基上，光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽；待外植体长到 3cm-4cm时，将外植体转移到不定芽生根培养基上，使生成不定根；将生长健壮的完整植 株移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化获得生长正常的转基因半夏植株；

所述转基因半夏外植体的消毒，是指：从转基因半夏植株上剥取外植体，用75％酒精 消毒10分钟，无菌水清洗3遍，0.1％HgCl₂消毒20分钟，无菌水清洗8遍。

所述外植体为含有顶芽的块茎，切去表皮部分，切成体积为3cm³-6cm³的小块。

所述生芽培养基是在MS培养基中添加1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、1.0mg/L萘乙酸、 30g/L蔗糖和8.5g/L琼脂粉。其中MS培养基为Murashige and Skoog于1962公布。

所述经光照培养，生成叶片叶柄，是指：培养温度为25℃±1℃，每天光照16小时， 10天后外植体长出4cm-6cm的顶芽。

所述待顶芽长到4cm-6cm时，切下叶片和叶柄是指切下幼嫩的叶片和叶柄，叶柄长 1cm-2cm、叶片面积为2cm²-4cm²。

所述微不定芽诱导培养基是在MS培养基中添加2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1(叶片) /0.25(叶柄)mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和8.5g/L琼脂粉；