[发明专利]促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及促胰岛素分泌肽同源二聚体的制备及用途，属于生物技术及药物领域。

背景技术

胰高血糖素类似肽(Glucagon-like peptide，GLP)是人体分泌的一种肠道激素，由胰高血糖素原分子经肠道蛋白水解酶裂解而成，产生二种胰高血糖素类似肽GLP-1和GLP-2。其中GLP-1有二种活性形成，即GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺形式，在体内具有相同的促进胰岛素分泌的作用，故又称促胰岛素分泌肽(Incretin或Insulinotropic peptide)(Negar Sadrzadeh et.al.，Pharmaceutical Sciences，Vol.96，1925-1954(2007))。

Exendin-4是在毒蜥的唾液分泌物中发现的蛋白多肽，由39个氨基酸组成。其氨基酸序列与GLP家族中数个成员有序列的相似性，其中与GLP-1(7-36)有53％的同源性(Eng J et.al.，J Biol Chem，1992，267：7402-7405)。作为一种GLP-1R的强激动剂，Exendin-4同样在体内外被证实促进胰岛素的分泌，因此也可以称为一种促胰岛素分泌肽。GLP-1(7-36)和Exendin-4的氨基酸序列如下：

GLP-1(7-36)：

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

Exendin-4：

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

Ser GlyAla Pro Pro Pro Ser

由于Exendin-4的第二位氨基酸Gly不同于GLP-1的Ala，可以有效抵抗二肽酰基肽酶IV的降解。此外，Exendin-4的C末端中多出的(PSSGAPPS)氨基酸序列，除可防止肽链内切酶降解外，尚可增强与GLP-1受体的亲和力。因此，Exendin-4在体内的降血糖能力比GLP-1强千倍左右。针对Exendin-4的改进而成的新型类似物众多，如在C末端增加5个KKKKK的类似物ZP10(Petersen JS，Diabetologia，2002，45：A147)：将其20位的Lys替换成Arg或His，25位的Trp替换Phe，将其14位Met替换成Leu或Ile。将Exendin-4从C末端缺失形成Exendin-4(1-28)或Exendin-4(1-30)以及相应的酰胺形式(T，DiabetesCare，2007，30：1608-1610.)。

GLP-1(7-36)和Exendin-4通过上述的序列改造，包括一个或多个氨基酸替换，或者C末端的氨基酸缺失或添加成截短的或延长的类似物。

GLP(7-36)和Exendin-4在体内半衰期分别为2min和2小时左右，为实现延长体内半衰期的目的，众多公开文献和专利报了将其与人血白蛋白、人Ig的Fc片段，转铁蛋白等的融合形式(如GLP-1-HSA，GLP-1-Fc，GLP-1-Transferrin，Exendin4-HAS，Exendin4-Fc等)(US7271149，US 2007/0036806 A1，US 2007/0060512 A1，US 2006/0293232 A1，US2007/0161087A1)。该类融合形式的GLP-1或Exendin-4主要通过基因工程重组技术表达和制备而实现，其表达宿主包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞(Xiaopu Yin，et.al.，Protein Expression and Purification 41(2005)259-265；Jin Zhou，et.ai.，Biotechnol Lett(2008)30：651-656；FehmannHC，et.al.，Peptides.1994；15(3)：453-456)。

在另外的公开文献和专利中报道由PEG修饰的GLP-1或Exendin-4的偶联物，主要偶联位点位于Lys上的氨基或C末端的COOH上(US 6284727，US9/561,226)。同样实现延长体内半衰期的目的。