[发明专利]一种用于检测大豆间座壳/拟茎点综合症的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测大豆间座壳/拟茎点综合症的试剂盒及检测方 法。

背景技术

大豆北方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora(DPC)、 大豆南方茎溃疡病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis(DPM)与近 似种大豆拟茎点种腐病菌Phomopsis longicolla(PL)在形态上很相似，经 常在大豆上造成复合侵然，引起间座壳/拟茎点综合症，是大豆生产上的毁 灭性病害，能导致生长期和成熟期的大豆成片死亡，曾在二十世纪四十年 代晚期和五十年代早期使美国中西部的大豆产量损失严重，1994年导致世 界大豆产量损失约为200多万吨；二十世纪八十年代茎溃疡又在南美大发 生，导致感病大豆品种的产量损失高达80％，1983年在美国东南部造成的 损失为三千七百万美元，1996年至2006年美国因溃疡病损失大豆155万 吨，1998年阿根廷、玻利维亚、巴西、加拿大、意大利、巴拉圭、美国因 茎溃疡病共损失大豆19.1万吨。大豆拟茎点种腐病菌能导致大豆根腐并影 响大豆种子质量，造成大豆品质下降及种子萌发率降低，严重时能导致90％ 的种子不能萌发，经济影响很大。目前这些病菌主要分布在美国、阿根廷、 巴西、加拿大、意大利、前南斯拉夫、克罗地亚、巴拉圭、欧洲等地。这 些病菌均可为害种子，并且以菌丝和子囊壳、分生孢子器的形式在大豆植 株残体上越冬，抗逆性很强，远距离传播主要通过大豆原粮贸易中的罹病 种子和病残体传播。我国是大豆的生产大国，目前国内还没有大豆北方和 南方茎溃疡病及拟茎点种腐病菌的发生，前两种病菌还是我国进境植物检 疫性有害生物，这些病菌的人为和自然传播对我国大豆生产构成了极大的 潜在威胁，准确快速的检测技术是阻止病菌传入的有效手段。近年来 RAPD、PCR-RFLP、血清学等方法已先后应用于大豆南北方茎溃疡病菌及 大豆拟茎点种腐病菌的鉴定，但是这些方法存在操作复杂或检测灵敏度不 高、或特异性不强、或重复性不好等缺点，在实际检测工作中难以推广应 用。通过形态学鉴定需极丰富的经验，容易误判，而且检测周期长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强 和价格便宜的检测大豆南北方茎溃疡病菌及大豆拟茎点种腐病菌的引物、探 针、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种大豆间座壳/拟茎点综合症的试剂盒，包括：含Buffer，Mgcl₂，dNTP， Taq酶的实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix、引物和 探针。

进一步来说，所述的大豆间座壳/拟茎点综合症的试剂盒，其组分为： 所述含Buffer，Mgcl₂，dNTP，Taq酶的实时荧光反应混合液TaqMan Universal PCR Master Mix每10μL，所述引物0.9μM，所述探针0.2μM。

进一步来说，所述引物包括：

A6PL1F序列为5′-GAGCGTCATTTCAACCCTCAA-3′的大豆拟茎 点种腐病菌上游引物，以及，

A6PL1R序列为5′-GGCCTTCCAGAGCGAGATATG-3′的大豆拟茎 点种腐病菌下游引物；

所述探针包括：

A6PL1M序列为5′-FAM-TTCGTCCAGAAAGC-MGB-3′的大豆拟 茎点种腐病菌探针。

进一步来说，所述引物包括：

DP1F序列为5′-AGCCAGGCTTGAGGGTTGA-3′的大豆间座壳/拟 茎点综合症通用上游引物，以及

DP1R序列为5′-GAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG-3′的大豆 间座壳/拟茎点综合症通用下游引物；

所述探针包括：

DP1P序列为5′- FAM-ACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGG-TAMAR-3′的大豆间座壳/拟 茎点综合症通用探针。

进一步来说，所述引物包括：

DM1F序列为5′-AGGCGCACCCAGAAACC-3′的大豆南方茎溃疡病菌 上游引物，以及，