[发明专利]一种基因定点多位点突变的方法

权利要求书

1.一种基因定点多位点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1根据突变的碱基所处序列的位点分别设计正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；根据需要进行突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；

S2由第一对引物以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；

S3采用DpnI酶将步骤S2中所得的基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；

S4以步骤S3中的酶切产物为模板，加入第二对突变引物进行PCR反应：在第一个循环时，两条引物在高保真酶的作用下形成构成质粒一部分的新链；在第二个循环时，两条链分别与引物的互补区结合，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分补充完整，得到具有两个突变位点的产物；在经过多次这样的循环后，即得到多个拷贝、具有两个突变位点、有开口的环状质粒；

S5以步骤S4中得到的环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物，按S4中的方式进行PCR反应，依次得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。

2.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S1设计的突变引物中，每条引物长度为24～38个碱基，正向引物与正义链一致，反向引物与正义链反向互补，两条引物之间5～20个碱基反向互补。

3.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S2、S4或S5中的PCR反应体系为：

10×PCR缓冲液       2.5μL

2mM dNTP混合物      2.5μL

25mM MgCl₂          1.2μL

正向引物(10μM)     0.1～1μL 

反向引物(10μM)        0.1～1μL

模板质粒(～200ng/μl)  0.5～5μL

DNA聚合酶              1～5U

灭菌的去离子水         至总体积为25μL。

4.据权利要求3所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，步骤S2、S4或S5中的PCR反应条件为：

94℃下变性0～5分钟；

94℃下变性15～30秒，55～65℃下退火30秒，68～72℃下延伸4～8分钟，并进行10～30个循环；

最后68～72℃下变性7分钟。

5.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S2、S4或S5中的高保真酶是高保真的DNA聚合酶。

6.根据权利要求1所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S3中酶切的反应体系为：

10×缓冲液    2μL

PCR产物       17.5μL

DpnI          0.5μL

总体积        20μL。

7.根据权利要求6所述的基因定点多位点突变的方法，其特征在于，所述步骤S3中酶切的反应条件为：

先在37℃下反应1-1.5小时，再在85℃下反应15-20分钟，使酶失活。