[发明专利]一种基因定点多位点突变的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基因定点多位点突变的方法。

【背景技术】

随着人类基因组计划的完成，生物工作者越来越多地把研究重点转移到基因功能上。基因定点突变技术正适应了这一要求。有目的地将蛋白链上某一个或几个氨基酸突变为其它的氨基酸，可以确定蛋白的结构和功能中心；将启动子上顺式反应元件的一个或几个碱基突变，可以探索该元件的功能中心。另外，定点突变技术也为基因工程改造、优化、提高酶的活性提供了一个途径。

现在市场上很多公司都有单点突变的试剂盒，如：外国的有invitrogen，clontech，stratagene；国产的有全式金。可是，对多位点定点突变，却只有stratagene的multi-site directed mutagenesis试剂盒。然而，这个试剂盒需要5’端磷酸化的引物、一种Taq酶和连接酶的混合物(该试剂盒独有的)，花费比较昂贵；而且突变产物为单链，转化效率不高。2004年，美国Seyfang等人发表文章，声称可以在一次PCR中做到10个位点以上的突变。但是，他们的方法需要引物5’端磷酸化、单独做一次退火、用T4DNA聚合酶延伸和T4连接酶连接，最后再进行PCR，花费稍显昂贵、操作稍嫌繁琐。2005年，丹麦Jensen等人发表了一种针对近距离的多基因突变的方法，是对stratagene公司的multi-site directed mutagenesis试剂盒的补充，弥补了该试剂盒不能做近距离的多基因突变的缺陷。但是这也限制了该方法在其他情况基因突变中的应用。2007年，我国中科院大连化学物理研究所的Wang等人，发表了一种不需要引物磷酸化、不需要连接，只用PCR进行基因突变的方法，该方法花费低廉、操作相对简单，应该算是比较理想的多位点突变的方法。然而，该方法除了PCR之外还需要进行两步胶回收，稍显复杂了些。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种以较低成本、较少时间来进行基因定点多位点突变的方法，利用含有突变位点的引物、通过PCR、Dpn I酶切消化模板质粒、再PCR的方法，来达成基因多位点定点突变的目的。

为达到上述发明目的，本发明提出以下的技术方案：

一种基因定点多位点突变的方法，包括以下步骤：

S1根据突变的碱基所处序列的位点分别设计一对正向突变引物和反向突变引物，突变位点位于正向引物的中间位置、反向引物靠近5’端的位置；根据需要进行突变的位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；

S2由第一对引物以高保真酶进行第一轮PCR反应，扩增出含第一突变碱基的基因片段；

S3采用DpnI酶将步骤S2中所得的基因片段进行酶切，去除模板质粒，得到具有一个目标突变位点、有开口的环状质粒；

S4以步骤S3中的酶切产物为模板，加入第二对突变引物进行PCR反应：

在第一个循环时，两条引物在高保真酶的作用下形成构成质粒一部分的新链；在第二个循环时，两条链与引物的互补区结合，在高保真酶的作用下，将每条链上缺失的部分分别补充完整，得到具有两个突变位点的产物；在经过多次循环后，即得到多个拷贝、具有两个突变位点、有开口的环状质粒；

S5以步骤S4中得到的环状质粒为模板，依次加入剩余的突变引物，按S4中的方式进行PCR反应，依次得到具有多个突变位点、有开口的环状质粒。

根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤S1设计的突变引物中，每条引物长度为24～38个碱基，正向引物与正义链一致，反向引物与正义链反向互补，两条引物之间约5～20个碱基反向互补。

根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，所述步骤S1或S2中的PCR反应体系为：

10×PCR缓冲液            2.5μL

2mM dNTP混合物            2.5μL

25mM MgCl₂                1.2μL

正向引物(10μM)           0.1～1μL

反向引物(10μM)           0.1～1μL

模板质粒(～200ng/μl)     0.5～5μL

DNA聚合酶                 1～5U

灭菌的去离子水            至总体积为25μL

根据本发明所提供的基因定点多位点突变的方法，步骤S1或S2中的PCR反应条件为：

94℃下变性0～5分钟；