[发明专利]检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，具体地说，涉及一种对美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey)进行简单、快速、特异、灵敏地探针实时荧光PCR检测方法及其试剂盒；适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey)已列入我国2007年5月公布的“中华人民共和国进境植物检疫危险性病虫杂草名录”，同时也列入欧盟检疫性有害生物名录。该病原菌为害李子、杏、桃、油桃、樱桃、梅李、苹果、梨和葡萄等多种水果以及木瓜属、山楂属、枇杷属等寄主，引起果腐、花腐和叶枯等。它既能在果园中引起危害，又能为害储藏期果实，还可在果实中潜伏侵染。该病菌在世界分布于北美洲、大洋洲、欧洲、亚洲、非洲、中美及加勒比海地区的许多国家，我国的北京部分桃园和台湾也有报道。我国从美国等国家进口大量李子、苹果等水果，美澳型核果褐腐病菌随贸易性水果进入我国风险极大，对我国的农业生产构成潜在威胁，因此，需要在口岸检疫部门严格加强检疫工作，防止该病原真菌的传入。

由于美澳型核果褐腐病菌与该属的另外两个种核果褐腐病菌(M.laxa)和欧洲种仁果褐腐病菌(M.fructigena)在病原菌形态特征、培养性状、危害症状等方面相似，用形态学方法不易区分，需要丰富的鉴定经验，一般需要经验丰富的真菌鉴定专家。而且需要分离培养，费时较长。

实时荧光PCR检测方法是一种在定性PCR基础上于1996年才发展起来的一种检测方法，该方法因为在PCR的同时加入了一段TaqMan探针，从而可以较有效地避免定性PCR无法避免的非特异性扩增和假阳性现象，该方法在医学上得到较广泛的应用，近几年该方法又应用于转基因产品的定量检测。在国外，实时荧光PCR首次应用于植物真菌病害检测领域是在2000年。在我国，章桂明、程颖慧等人首次于2001年将实时荧光PCR检测方法应用于小麦印度腥黑穗病菌及其近似种的检测中。

TaqMan MGB探针方法是在TaqMan方法之后产生的更新的方法，MGB的全称为Minor Groove Binder，在2001年被推出。与TaqMan探针相比，其原理是TaqMan MGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记；二是探针的3’端另结合了Minor Groove binder结合物，使探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。

但是，将TaqMan MGB探针的实时荧光PCR检测方法应用于病原真菌的检测，无论在国外，还是在国内，还是刚刚起步，需要做更多的探索研究工作。

发明内容

本发明的目的意在于提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜地检测美澳型核果褐腐病菌的引物、探针、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明提供了一条引物，其序列为SEQ ID NO：1：SZMfc-F  5’-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’。

还提供了另一条引物，其序列为SEQ ID NO：2：

SZMfc-R  5’-CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’。

又提供了一条寡核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO：3：5’-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3’，其中FAM为荧光分子，MGB指另结合了Minor Groove binder结合物。

还提供了用于美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的引物及寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性检测美澳型核果褐腐病菌的TaqManMGB探针和特异结合的寡核苷酸序列。

优选地，所述引物具有如下的核酸序列：

SZMfc-F：5’-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’SEQ ID NO：1

SZMfc-R：5’-CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’SEQ ID NO：2。

优选地，所述寡核苷酸探针具有如下的核酸序列：

SZMfc-Pb：5’-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3’SEQ ID NO：3。

本发明另提供了一种用于美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物和寡核苷酸探针。

本发明还提供了一种美澳型核果褐腐病菌实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：