[发明专利]鹿流行性出血病病毒检测试纸条及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种用于检测鹿流行性出血病病毒抗原的快速检测试纸条，以及这种快速检测试纸条的制备方法。

背景技术

鹿流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease of deer，EHD)是一种非接触性的病毒性传染病，其由呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Obivirus)的鹿流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer，EHDV)引起，并由节肢动物(主要是库蠓)传播。牛、绵羊等家畜及白尾鹿、糜鹿、大角羚羊等多种驯养和野生反刍动物都可感染该病。EHDV的基因组与BTV相似，目前共发现有8个血清型。

鹿流行性出血病最早在美国发生，病死率高达62％。1960年，日本牛群流行此病，发病率达整个流行地区的1.96％，大约有4000多头牛死亡。据NoonTH等(2002)报道，最近美国亚利桑那州出现了绵羊和鹿的EHD，有扩大流行的趋势。该病在日本、中国台湾、朝鲜都有报道。2003年美国一养鹿场因EHD死亡150头鹿。2004年，美国维吉尼亚洲在60公里范围内由EHDV2引起228头鹿死亡。由于EHD可引起家畜和野生动物的严重出血热病，影响了动物及其产品的对外贸易。控制和消灭EHD必须花费大量的人力物力，给EHD流行的国家带来很大的经济损失。

目前，EHD确诊主要靠病毒分离和血清学诊断方法。由于蓝舌病病毒和EHDV间存在血清交叉反应，作为群特异性的诊断方法如琼脂免疫扩散试验、补体结合试验、荧光抗体技术不能完全区分这两种病。有人已应用牛IgG1单克隆抗体建立了间接ELISA，并对实验感染牛和自然感染牛进行研究，取得了很好的效果。美国、加拿大、澳大利亚等国利用单克隆抗体建立了竞争ELISA(c-ELISA)，并已广泛应用。然而，c-ELISA在临床应用或直接用于样品检测时常缺乏足够高的灵敏度，且只有收集感染2周以上患病动物血液样品才能检出EHDV抗体。因此，在实际检疫工作中需要一种灵敏、特异，能尽快得出结果的方法，为EHD的诊断、流行病学调查、疫情监控及防制等提供理想手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对上述现有的鹿流行性出血病检疫方法灵敏度不高的问题，提供一种鹿流行性出血病病毒检测试纸条及制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种鹿流行性出血病病毒检测试纸条，包括底板及依次固定在所述底板上的样品吸收垫、硝酸纤维膜和吸水垫，其中所述样品吸收垫包括胶体金垫，所述胶体金垫为吸附有胶体金标记单克隆抗体的多孔纤维，硝酸纤维膜上设有相互平行的检测线及对照线，所述检测线上包被或喷有鹿流行性出血病病毒多克隆抗体，所述对照线上包被或喷有重组蛋白A。

在本发明所述的鹿流行性出血病病毒检测试纸条中，所述胶体金垫通过以下方法制备：通过柠檬酸钠还原法烧制直径20nm～50nm胶体金颗粒，将鹿流行性出血病病毒的单克隆抗体溶于胶体金溶液后使用滤膜过滤纯化获得胶体金标记的单克隆抗体溶液，最后将胶体金标记的单克隆抗体溶液吸附多空纤维获得胶体金垫。

在本发明所述的鹿流行性出血病病毒检测试纸条中，所述鹿流行性出血病病毒的单克隆抗体通过以下方法制备：从经纯化的鹿流行性出血病病毒免疫三次的巴比赛小鼠取脾细胞，使用所述脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合并使用间接酶联接免疫吸附剂测定法检测分泌抗EHDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，将抗EHDV的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞注入巴比赛小鼠腹腔制备单抗腹水，最后采集并纯化单抗腹水获得所述鹿流行性出血病病毒的单克隆抗体。

在本发明所述的鹿流行性出血病病毒检测试纸条中，所述多孔纤维为玻璃纤维。

在本发明所述的鹿流行性出血病病毒检测试纸条中，所述检测线位于硝酸纤维膜上靠近样品吸收垫的一端，所述对照线位于硝酸纤维膜上靠近吸水垫的一端。

在本发明所述的鹿流行性出血病病毒检测试纸条中，所述胶体金垫位于样品吸收垫上靠近硝酸纤维膜的一端且部分覆盖所述硝酸纤维膜。

本发明还提供一种鹿流行性出血病病毒检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

制备鹿流行性出血病病毒单克隆抗体并使用所述鹿流行性出血病病毒单克隆抗体制备胶体金标记单克隆抗体；

制备包括胶体金垫的样品吸收垫，所述胶体金垫为吸附有胶体金标记单克隆抗体的多孔纤维；