[发明专利]孔雀石绿胶体金检测卡及其生产和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种孔雀石绿胶体金检测卡，属于免疫学技术领域。

背景技术

孔雀石绿作为一种杀真菌剂在渔业中被大量使用，带来了极大的危害。孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色；溶于甲醇、乙醇和戊醇。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。科研结果表明，孔雀石绿在鱼体内残留时间非常长，且其具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。但是，因为其价格便宜，而且其治疗水霉病等的功效是其他药物所“不能替代”的，由于利益的驱动使得孔雀石绿并没有退出渔业市场。

从上世纪90年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿(隐性孔雀石绿)具有高毒素、高残留、高致癌和高致畸变、致突变等副作用。2005年6月，英国食品标准局向所有欧洲国家发布食品安全警报，在英国一家超市发现鱼体内含孔雀石绿。英国食品标准局发布消息说，孔雀石绿是一种对人体有极大副作用的化学制剂，任何鱼类都不允许含有这一物质，并且这种物质不应该出现在任何食品中。没过多久，国内就有媒体报道，在国内很多地方，尤其是河南、湖北等地的水产养殖和水产品运输过程中，孔雀石绿仍在被普遍使用。重庆市执法部门在某水产交易市场查获600多只含有孔雀石绿的甲鱼。有些地区则在鳗鱼制品中检出孔雀石绿。记者从我国鳗业工业委员会了解到，从今年7月1日起，日本政府开始对来自我国的鳗鱼产品强制检测孔雀石绿。所以，对于我国输日鳗鱼制品来说，又面临出口贸易壁垒的考验。农业部办公厅于2005年7月7日发布了关于组织查处“孔雀石绿”等禁用兽药的紧急通知，要求各地尽快组织开展孔雀石绿等禁用药物的专项整治工作。

孔雀石绿是小分子化合物，常用的检测方法有高效液相色谱分析法(HPLC)和气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)或液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作烦琐，试剂消耗量大的局限性。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测，基于免疫学检测原理，操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和设备，特别适于现场检测。能够在第一时间检测水产品中孔雀石绿残留，对遏制孔雀石绿的非法使用具有重要意义。而国内外尚无该技术监控孔雀石绿的报道。

发明内容

针对上诉问题，本发明提供了一种孔雀石绿胶体金检测卡，该快速诊断卡检测快速、准确、稳定。

本发明的另一个目的是提供该胶体金检测卡的应用。

上述孔雀石绿胶体金检测卡的制备包括以下步骤：

(1)孔雀石绿半抗原的合成

(2)孔雀石绿免疫抗原的合成；

(3)孔雀石绿单克隆抗体的制备；

(4)胶体金颗粒的制备；

(5)胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体；

(6)样品垫的制备，该垫附置一段胶体金标记孔雀石绿单克隆抗体的膜；

(7)孔雀石绿包被抗原的合成；

(8)孔雀石绿固相硝酸纤维素膜的制备，该膜包被一条含孔雀石绿包被抗原的检测带和一条包被羊抗鼠IgG的质控带；

(9)样品垫的处理：选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用；

(10)组装孔雀石绿胶体金检测卡，该检测卡用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。

所述的半抗原具有式(I)所示结构：

所述的免疫抗原具有式(II)所示结构：

所述的包被抗原具有式(III)所示结构：

发明通过以下操作步骤进行孔雀石绿检测：

(1)取待检水产品可食部分用绞肉机绞碎后准确称取10.0g于50mL离心管中，加入提取剂，混匀振摇5分钟后取上清液4mL于50mL离心管中，加缓冲液3滴，然后稀释至25mL；

(2)分次把上清液加入层析柱中，用抽提装置从下口加压，加快流速，待完全流干后加4mL蒸馏水洗涤层析柱；

(3)将1mL衍生化试剂加到层析柱中完全流干后，再加入2mL蒸馏水洗涤层析柱，再用1mL洗脱液洗脱收集，加1滴缓冲液后振荡混匀得到待检液。