[发明专利]表面增强拉曼光谱检测动物活性单细胞样品处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种单细胞表面增强拉曼光谱检测样品预处理方法，具体说是一种将用于单细胞表面增强拉曼光谱检测的检测样品——动物活性细胞进行预处理，并利用电穿孔法将金属纳米粒子导入检测样品内的方法，属于生物医学领域。

背景技术

拉曼光谱属于分子振动光谱，拉曼谱线的数目，位移值的大小和谱带的强度等都与物质分子的振动和转动有关，这些信息反映了分子的构像及其所处的环境。拉曼光谱可提供关于分子内部各种简正振动频率及有关振动能级的情况，从而可鉴定分子中存在的官能团及分子的特征结构。然而拉曼光谱散射的光强仅约为入射光强的10^-10，由于常规拉曼信号太弱，需要采取技术手段对拉曼信号进行增强后进行检测，表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Ramanspectroscopy，简称SERS)就是通常采用的一种具有表面选择性的增强手段。SERS是指当一些分子被吸附到某些粗糙的金属(如银、铜、金等)表面上时，它们的拉曼散射强度会增加10⁴～10⁶倍。这就是所谓的SERS效应。SERS以其选择性好，高灵敏度，对某些分子其灵敏度比常规拉曼光谱高100万倍，能检测吸附在金属表面的单分子层和亚单分子层，并提供丰富的分子结构信息，而得到广泛的应用。在生物医学研究上，科学家目前采用在细胞内部导入银或金纳米粒子的以获得SERS谱研究活性细胞，SERS具有非破坏性和指纹式的分辨能力，对水溶液样品的分析、样品的选择性激发和信号收集等方面都显示出其独特的优点，因此在生物医学研究方面已经展现出良好的应用前景。然而目前将银或金纳米粒子导入活性细胞的手段还不多，通常采用直接与细胞孵育方式，利用细胞的胞吞作用将吸附在细胞表面的金属粒子引入活性细胞，这种方式需要的时间较长而且效率不高，另外细胞会将附着有金属的纳米粒子视作异物，并很快将这些纳米粒子清除干净进一步降低了导入效率。

在正常的生理机能状况下，细胞膜起着内外环境的屏障作用，能较好地阻碍内外环境中纳米粒子或分子的传输。但是当施加强度为KV/cm、持续时间为μs～ms级的电脉冲刺激细胞膜时，细胞膜会出现微孔，导致细胞膜阻碍微粒渗透能力降低。这种由电脉冲产生的细胞膜渗透性通常称之为电穿孔。如果通过调节脉冲电场的强度和持续时间可以控制细胞膜的开孔直径，在最佳条件下，保持微孔直径在20～100nm范围内，并使微孔在10s左右自动愈合，可使细胞有效地通透，又可使细胞损伤最小保持活性，达到既能将所需的金属粒子导入细胞内，又能保持细胞的活性。

发明内容

本发明目的在于就现有方法不足提供一种利用电穿孔法将金属纳米粒子快速导入检测样品(动物活性细胞)的方法。与现有预处理技术需要8～24小时相比，本发明所述的进行表面增强拉曼光谱检测样品预处理过程所需要的时间缩短至30分钟以内，具有简单快速、可靠性高、通用性好的特点，它既不影响原有细胞的活性，又有显著的表面增强拉曼效果，可获得活性细胞内部清晰稳定的表面增强拉曼光谱。

为实现本发明的目的采用的技术方案是：

(1)银溶胶预制备

取9～12mg的固体硝酸银溶于50ml去离子水中，加热至100℃，然后将1ml含有1％～3％的柠檬酸三钠的水溶液逐滴加入，在加入过程中快速搅拌硝酸银溶液，滴加完后继续保持沸腾2小时～6小时，得到银溶胶的粗制品，待银溶胶自然冷却后，用离心机离心分层，将上清液丢弃，取下层浓缩的银溶胶在室温下避光密封以准备下面的细胞电穿孔步骤。

(2)单细胞悬液的制备

将待测的检测样品活性细胞首先用市售的RPMI 1640细胞培养液制成单细胞悬液，然后通过血球记数板计算细胞的含量，控制细胞密度在10⁵～10⁶个/ml。

(3)银溶胶-单细胞悬液混合液的制备

取(1)中制备好的银溶胶1～4ml于以8000rpm转速进行第二次离心10分钟，弃上清液后向浓缩的银溶胶中加入50～200μl市售的RPMI 1640细胞培养液制成银溶胶悬浮液。将银溶胶悬浮液与(2)中制备的单细胞悬浮液按1∶4的体积比例混合于一试管管中，利用200μl的移液器通过反复抽吸的方式充分将银溶胶悬浮液和单细胞悬浮液混匀，制成银溶胶-单细胞悬浮液并在室温下保存。

(4)表面增强拉曼光谱检测样品预处理过程