[发明专利]用于检测人类K-ras基因突变的引物、探针及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因突变检测引物及该引物的使用方法，具体地涉及一种能检测人类K-ras基因7个热点突变的引物及其使用方法。 

背景技术

肿瘤发生发展的重要因素是细胞增殖、分化失控，细胞凋亡障碍及血管生成通路异常，它是一个多基因改变的积累过程。近年来研究显示K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。突变K-ras基因使本应正常死亡的细胞的生存期延长，K-ras基因过度表达还能增加抗药物和紫外光诱导的凋亡，可能的机制是K-ras基因增强了细胞分解过氧化氢的能力从而抑制凋亡。K-ras基因能够根据激活信号的强度和质量、细胞类型和代谢环境诱导细胞抗凋亡通道，因此对K-ras基因突变的检测将有助于控制肿瘤细胞生长和凋亡制定出有效的治疗方案。 

K-ras基因在调节细胞生长和分化方面具有重要作用，大约70％的肿瘤在不同程度上都与12、13位密码子突变有关，其它密码子突变在59、61位上。K-ras基因在骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤中均有高表达，K-ras基因激活与促进恶性骨肿瘤细胞的浸润及转移有关。而K-ras基因活化又与IV型胶原酶的高表达有密切联系，因此认为这种改变可能是K-ras基因促进肿瘤细胞侵润转移的分子调节机制之一。 

K-ras基因在燕麦细胞癌中突变率占33％，结肠癌占44％，胰腺癌占90％。如果这些患者服用相关药物如Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等药物，治疗效果不明显，如果样品为野生型，这些靶向药物对某些人群疗效非常好，但是价格昂贵，如果病人携带有K-ras突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有K-ras基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关的K-ras基因突变成为人们亟待解决的问题。 

建立对肿瘤病人K-ras基因突变检测方法不同于检测一般性的遗传突变，一般的遗传性突变即便是杂合性突变(异质性)和野生比例永远是1/1，靠一般的探针技术就可以对突变和野生进行很好的区分。然而，这些K-ras突变都是体细胞突变，提取模板中存在大量野生型DNA，突变所占比例不确定，直接来自手术切除的样品，突变比例高，可能达到 20％以上，或许突变含量只有0.1％。虽然可以通过显微激光捕获样品中的肿瘤细胞，提高样品中肿瘤细胞的比率。不过即便是肿瘤细胞，也不是100％的肿瘤细胞都带有此类突变，处于不同肿瘤组织部位的细胞或许不太一样。如果是来自血液的样品突变含量或许会更低。这就是稀有突变检测的难点：一面要具有高灵敏的检测能力——个位数甚至单个突变拷贝，另外必须保证极高的特异性——面对上千倍上万倍的野生型模板的干扰，不出现假阳性。 

目前检测K-ras基因稀有突变的方法有多种，检测能力在1％～20％。主要有两大类，一类是非实时PCR，主要有测序和DHPLC，检测能力仅为20％和5％，而且需要PCR后处理，步骤繁琐，耗时长，容易污染；另一类是实时PCR，虽然都是基于实时PCR的技术平台，但是为了提高检测方法的选择能力，不同学者所用策略不尽相同。主要有完全依赖DNA序列自身识别特异性和依赖酶识别特异性两大类策略，有TaqMan探针、高分辨熔解曲线分析、竞争性抑制实时PCR方法，检测能力5％～20％之间，DxS蝎子引物法检测能力可达1％。 

近年来，研究发现在病人的外周血液中能够检测到癌细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤早期诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血血清中检测到K-ras突变。认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道靶向药物靶标位点的分子学特征，从而判断哪个药物对病人最有效。但是，外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般小于0.2％，即便是手术切除的肺癌组织中也混杂了大量的正常细胞，而且并不是所有的肿瘤细胞都带有突变。上述方法不能满足越来越多的无创的突变检测需要，因此能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。 

发明内容：

为了克服现有技术检测能力有限，现提供一种荧光PCR检测K-ras基因突变的方法。 

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：针对K-ras基因的7个热点突变，设计的突变型引物以及特殊探针对待测样品分8个PCR管进行检测，其包括以下步骤： 

(1)根据K-ras基因12和13密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和多个特异性双环探针。