[发明专利]桡足类单个卵的DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA提取技术，尤其是对桡足类的单个卵，包括不同产卵方式、不同 生理状态以及不同卵径都实用且迅速有效的一种新型的DNA提取方法。

背景技术

目前，世界上针对浮游动物单个卵提取的方法主要有两种，一种是Montero-Pau等 (Montero-Pau et al.Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.Limnology and Oceanography： Methods，2008，6：218-222)提出的HotSHOT方法，该方法主要针对的是浮游动物滞育卵 单个卵基因组DNA的提取，其操作步骤主要包括以下几个步骤：加入一定量的裂解缓冲液； 通过物理手段和工具把滞育卵捣破；最后通过一个热孵和冷击的过程使基因组DNA得以释 放。另一种方法是Walsh等(Walsh et al.Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.BioTechniques，1991，10：506-513)提出的Chelex-100 方法，该方法的原理简单，与第一种方法类似，不同的是在这种方法提取的过程中首先加入 裂解液，随后加入由美国伯乐(Bio-Rad)公司生产的Chelex树脂，通过物理手段对卵进行 破碎，继而通过一个热孵过程最后来得到基因组DNA。当然，随着科学技术的不断进步，各 种商业试剂盒针对微小组织和个体基因组DNA提取应运而生，这些试剂盒包括有美国 Promega公司生产的genomic DNA purification kit，德国Qiagen公司生产的Qiagen DNeasy tissue extraction kit等等。上述提到的各种商业的试剂盒的原理跟目前世界上普遍采用 的两种方法提取单个卵基因组DNA的原理相似，只是商业试剂盒都通过膜的吸附和洗脱完 成对DNA的收集和纯化。值得一提的是目前普遍使用的两种针对浮游动物单个卵DNA提取 的方法和后来层出不穷的商业试剂盒都存在不少的问题，归纳起来主要有以下几点：1、目前 流行的两种方法都通过物理的手段和工具来对卵的结构进行破坏，这个操作将会使得提取到 的DNA量比理论上要少，这些是由操作所带来的人为的损失，并且对本身DNA含量不高的 单个卵来说这个损失是巨大的；2、在Chelex-100这种方法中，本身加入的树脂无形中增加 了污染的机会，同时实践已证明了树脂的加入对下游PCR实验具有很大的抑制作用；3、商 业试剂盒主要通过膜的吸附和洗脱等过程来完成DNA的收集和纯化，DNA质量得到提高的 同时洗脱效率直接影响到DNA的浓度，这也将直接影响到下游的PCR实验。

上述的均为国外在这方面的研究进展，至今，未见国内对桡足类单个卵基因组DNA的 提取工作的报道。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术对单个浮游动物单个卵基因组DNA提取时的不足， 提供一种桡足类单个卵的DNA提取方法。包括不同卵径和不同产卵方式所产生的单个卵。 此方法不仅能够尽量保证DNA的提取的效率同时提取到的DNA可以直接应用到下游PCR 实验。

本发明包括以下步骤：

1)将桡足类单个卵置于1×TE缓冲液中，加入蛋白酶K，使蛋白酶K的终浓度达2.5～ 5.5mg/mL，得混合提取液；

2)将得到的混合提取液通过一个热孵程序，得单个卵DNA的粗提液；

3)对单个卵DNA的粗提液由核酸共沉剂(DNA Mate)进行沉淀，得DNA沉淀。可将 沉淀物溶于灭菌水中，存于冰箱中备用。

在步骤1)中，所述1×TE缓冲液的pH最好为7.5～8.5，加入蛋白酶K的目的主要是通 过蛋白酶K的作用来破坏卵的外部结构使得内部的DNA能够被顺利释放出来，同时也避免 了物理破坏给DNA带来的损失。

在步骤2)中，所述热孵程序的具体程序如下：37～60℃放置25～120min，然后在95℃ 温度下放置5min。