[发明专利]一种用根霉发酵转化生产α-熊果苷的方法

说明书

一、技术领域

本发明属于一种用根霉发酵转化生产α-熊果苷的方法。

二、技术背景

熊果苷是对苯二酚(氢醌)的葡萄糖苷，化学名为4-羟苯基-D-吡喃葡萄糖苷，分为α-熊果苷和β-熊果苷两种。熊果苷是皮肤黑色素合成途径的关键酶酪氨酸酶的抑制剂，它阻断多巴及多巴醌的合成，从而抑制黑色素的生成而发挥其美白作用，且对皮肤没有刺激性，毒副作用小，是国际公认的高效祛斑美白剂，其中α-熊果苷的美白作用是β-熊果苷的10倍。熊果苷还具有镇咳、祛痰、抗炎、抗菌等生理活性，因而被用作镇咳药物和尿道消毒剂等使用。β-熊果苷可以通过化学合成法、天然植物提取法、植物细胞培养法和微生物发酵转化法几种方法来制备，而α-熊果苷一般只能通过微生物发酵转化法制备，已有用细菌发酵转化生产熊果苷的报道。目前熊果苷的主要生产方法是化学合成法，其步骤繁杂，反应条件苛刻，且所得产物大多是α-熊果苷和β-熊果苷的混合物，分离纯化困难，而且随着人们崇尚自然绿色化妆品的需求，人们对天然熊果苷的需求将使得化学合成法逐渐被生物转化法取代。微生物发酵转化法作为一种较新的熊果苷生产技术，具有原料较简单，发酵条件容易控制，生产周期短，合成效率高，产物纯度高，一般多为α-熊果苷，生产成本低，易于大规模生产，生产更符合环保和可持续发展的要求等优点，因此具有工业化意义，发展前景非常乐观。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种用根霉发酵转化生产α-熊果苷的方法，该方法能在常温常压下合成熊果苷，原料较简单，能够克服化学合成法反应条件要求苛刻，对环境污染大的问题。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种用根霉发酵转化生产α-熊果苷的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备根霉细胞

将从淀粉厂周边、农田、果园等地方采集的土壤样品中筛选所获得的根霉接种于根霉种子液中，于31-34℃、pH 5.0-6.0、180r/m下培养40-46小时，制备得根霉种子液，将制备得的根霉种子液过滤得到根霉细胞。

(2)接种到熊果苷转化液中

将(1)制备得的根霉细胞按4-5％(w/v)的接种量接入熊果苷转化液中，于31-34℃、pH 3.2-4.2、170-200r/m下转化96-120小时，获得含α-熊果苷的转化液。

(3)将所述含α-熊果苷的转化液分离、纯化，得到α-熊果苷纯品。

所述根霉的种子液和熊果苷转化液的组成为：

(1)所述根霉种子液的组成(w/v)为：2％麸皮，3％木薯粉，

(2)所述熊果苷转化液的组成(w/v)为：60-80mmol/L对苯二酚，180-320mmol/L麦芽糖或180-480mmol/L葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木薯粉水解液、玉米粉水解液的一种，50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

所述根霉通过以下方法获得：

(1)筛选

从淀粉厂周边、农田、果园等地方采集土壤样品，经稀释后涂布于固体平板培养基上，固体平板培养基的组成(w/v)：2％葡萄糖、5％麸皮浸出液、0.05％MgSO₄、1.2％琼脂，于pH 5.0、32℃下培养，待长出根霉单菌落，取根霉孢子于固体平板培养基上进一步纯化，将纯化的根霉接种于根霉种子液中，于32℃、转速为180r/min的摇床中培养46小时，制备得根霉种子液，将制备得的根霉种子液过滤得到根霉细胞。按5％接种量将根霉细胞接入熊果苷转化液中，转化液的组成：210mmol/L麦芽糖、70mmol/L对苯二酚、50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于pH 4.0、32℃、180r/m下转化120小时，测定转化液的α-熊果苷含量，选取转化成α-熊果苷含量最高的根霉。

(2)保存

将根霉接种于固体平板培养基上，于pH 5.0，32℃培养96小时后，于4℃冰箱中保存。

本发明的技术优点如下：

1、使用的熊果苷转化液的组成成分简单、经济，能适应于范围较广的原料转化。

2、使用的转化工艺条件温和、工艺步骤简单。

四、具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

1、发酵转化生产α-熊果苷的根霉的筛选保存

(1)筛选