[发明专利]一种莪术醇半抗原和人工抗原及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种莪术醇半抗原、人工抗原及其制备方法，属于免疫学技术领域。

背景技术

免疫分析是一种基于抗原抗体抗原抗体特异性识别和结合反应的分析方法，不仅可用于测定蛋白质、酶等大分子物质，而且还广泛用于测定小分子量的药物，特别适用于那些色谱法难以分析的药物，该法已成为药物分析中一种必不可少的基本检测技术。免疫分析不仅为临床诊断提供了依据，在内分泌学、病毒学、药理学、血液学及肿瘤学等研究方面得以应用，而且在农业科学、食品科学、环境保护、生态学及法医学等领域的应用也有所进展。免疫分析具有检测灵敏度高、特异性强、前处理简单、反应速度快、检测费用低廉，适于现场监控和大批量样品分析的特点。

莪术醇(curcumol)又名姜黄环奥醇，姜黄醇，属萜类化合物，是莪术挥发油中的重要成分。具有抗癌、抗早孕、抗病毒、抗突变、保肝、活血化瘀等药理作用。特别是在免疫分析检测方面具有独特作用，但莪术醇为小分子天然化合物，相对分子质量较小，仅具有反应原性，而不具有免疫原性，因此不能直接采用免疫方法检测，需要与大分子蛋白等偶联形成复合物后才能成为完全抗原。但是小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团(如氨基，羧基，重氮基等)，对于含羟基的半抗原需要将其羟基衍生为羧基再与蛋白质载体交联合成人工抗原。根据莪术醇结构中存在C₆羟基的特点，先将莪术醇的羟基衍生为羧基，然后再与大分子蛋白偶联形成复合物，从而成为完全抗原才行。

发明内容

本发明的目的是提供一种莪术醇半抗原和人工抗原；

本发明的另一个目的是要提供上述莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法，所制备出的产品用于含有莪术醇的中草药的免疫方法研究，其制备方法合成步骤简单，实验条件温和，产物容易得到，且产率较高。

实现本发明的技术方案是：一种莪术醇半抗原和人工抗原的制备方法，以莪术醇为原料，利用丁二酸酐与莪术醇反应生成莪术醇琥珀酸单酯(Cur-HS)，得到莪术醇人工半抗原，用MS质谱和¹³C-NMR谱测定半抗原的结构；将莪术醇半抗原制备成吡啶水溶液，然后使之与牛血清蛋白结合，制得莪术醇人工抗原，即Cur-HS-BSA，用MALDI-TOF-MS鉴定莪术醇人工抗原；其反应方程式为：

(1)莪术醇琥珀酸单酯(Cur.-HS)

莪术醇                   丁二酸酐    莪术醇琥珀酸单酯

(2)莪术醇人工抗原Cur.-HS-BSA

莪术醇琥珀酸单酯            牛血清蛋白    莪术醇人工抗原

本发明所述莪术醇半抗原的制备方法步骤如下：

1、取三氯甲烷置于反应瓶，加入少量无水MgSO₄，搅拌过夜，滤去MgSO₄；

2、取上述滤液，加入莪术醇和丁二酸酐，搅拌溶解，加入适量的4-甲基氨基吡啶，于65℃回流，TLC检测反应进度，反应结束，冷却；

3、将反应物倾入冰水中，用乙醚萃取，合并有机相，回收有机溶剂，得莪术醇半抗原粗品；

4、用石油醚-乙酸乙酯进行硅胶柱层析，得到纯度较高的莪术醇丁二酯油状物，此即为莪术醇半抗原莪术醇琥珀酸单酯，置4℃冰箱保存；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为8∶1。

将上述所得产品用MS质谱和¹³C-NMR谱测定其结构，从Cur-HS的MS(APCI)m/z：337.14(M^-)，推出其分子量为336，初步认为Cur-HS为合成的目标产物；再分别测定出原莪术醇、Cur-HS的¹³C-NMR谱，比较两者¹³C-NMR谱的不同，发现产物多出δ172.48，169.15，30.2，29.13，共四条谱线，其中δ169.15为莪术醇成丁二酸单酯后酯羰基碳原子，δ172.48为莪术醇成丁二酸单酯链羧基羰基碳原子，而δ29.13，δ30.2为丁二酸单酯链中2个亚甲基碳原子。结合MS的数据，对原料莪术醇和和合成出的产物碳谱的化学位移数据的差异分析表明，从而确定合成出的产物就是所需要的目标产物Cur-HS。

本发明所述莪术醇人工抗原的制备方法步骤如下：

1、称取莪术醇琥珀酸单酯，加入吡啶和H₂O，搅拌溶解，所加入的吡啶与H₂O的体积比为1∶1；