[发明专利]一种萤火虫荧光素酶及制备方法

权利要求书

1、一种萤火虫荧光素酶，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

2、一种编码权利要求1所述萤火虫荧光素酶的DNA分子，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

3、包括权利要求2所述DNA分子的重组表达载体。

4、包括权利要求2所述DNA分子的重组表达载体pPLagg-1-Luc。

5、包括权利要求3所述重组表达载体的转化体。

6、包括权利要求3所述重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)-pPLagg-Luc。

7、一种制备如权利要求1所述萤火虫荧光素酶的方法，包括将权利要求3所述重组表达载体转化入寄主细胞，得到如权利要求5所述的转化体，培养转化体，诱导表达重组的萤火虫荧光素酶后，在高盐条件下沉淀该萤火虫荧光素酶，即得纯化的萤火虫荧光素酶。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，在上述的分离和纯化步骤，包括：

(1)在菌株裂解得到的粗提物中加入buffer AGG-C，充分混匀后置37度5分钟，15,000g室温离心15分钟，弃去上清；

(2)沉淀用buffer AGG-D充分重悬后，15,000g室温离心15分钟，弃去上清；

(3)沉淀以buffer AGG-E充分重悬，15,000g离心15分钟，弃去沉淀；收集上清液，即得到纯化的萤火虫荧光素酶；

上述的buffer AGG-C包括5M NaCl；buffer AGG-D包括1.6M NaCl；bufferAGG-E包括50mM Tris-Cl，pH8.0，50mM NaCl，10％甘油。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：菌株裂解得到粗提物的步骤，包括：

(1)收集诱导表达的培养菌液，8000g室温离心5分钟，弃去上清；

(2)菌体沉淀用buffer AGG-A重悬，悬浮液以8000g室温离心5分钟，弃去上清；

(3)沉淀用buffer AGG-B重悬，悬浮液进行超声破碎，然后16,000g 4度离心20分钟，弃去沉淀，上清液至冰上备用，该上清夜即为粗提物；

上述的buffer AGG-A包括20mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA；bufferAGG-B包括50mM Tris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，5％甘油。

10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在得到纯化的萤火虫荧光素酶后，保存该萤火虫荧光素酶，在保存步骤中，将该纯化产物转移至透析袋中，在buffer AGG-F中透析24h，透析后经离心浓缩管浓缩后，加入甘油至终浓度为50％，-20度避光储存，上述的buffer AGG-F包括20mM Tris-acetate，pH7.4，1mM DTT，1mM EDTA。

11、一种包含有如权利要求1所述萤火虫荧光素酶的荧光试剂。

12、一种通过测量ATP来进行检测的测试试剂盒，其特征在于：该试剂盒中包含如权利要求10所述的荧光试剂。

13、一种检测方法，是通过测量ATP进行的，其中ATP的测量是通过萤火虫荧光素和萤火虫荧光素酶反应发光进行的，反应产生的光的量与ATP的量有关，其特征在于：该检测方法中，萤火虫荧光素酶为权利要求1所述的萤火虫荧光素酶蛋白。