[发明专利]一种萤火虫荧光素酶及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种萤火虫荧光素酶及制备方法，具体涉及一种萤火虫荧光素酶的氨基酸序列以及编码该荧光素酶的DNA分子的碱基序列，利用含有该DNA分子的重组表达载体和转化体制备萤火虫荧光素酶的方法。

背景技术

萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)属氧化还原酶类，是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂，该萤火虫荧光素酶在ATP、Mg²⁺和氧气存在时，以荧光素(luciferin)为底物，进行氧化反应，发出光子。ATP是所有生物体都具有的一种重要的能量化学物质。ATP生物发光计数法利用了ATP与萤火虫荧光素-荧光素酶复合物的特异生化反应来测定样品中ATP的含量：当荧光素底物和荧光素酶处于过量饱和的情况下，每一分子ATP释放出一个光子，因此光的强度与检测样本中ATP的水平成正比；高灵敏的ATP荧光检测仪能及时读取释放光子的数量，以相对发光强度(RLUs)来显示ATP的含量，因此这种发光特性使得萤火虫荧光素酶能够在各种各样测定ATP的研究中广泛应用。

早期萤火虫荧光素酶的获得主要通过从萤火虫发光器官中提纯得到。DewetJ.R.等于1985年首次克隆了北美萤火虫(P.Pyralis)的荧光素酶基因，并在大肠杆菌中表达，得到具有生物活性的荧光素酶。与自然提取得到的荧光素酶相比，具有同样的反应动力学特性和发射波长，在相同反应条件下酶稳定性也没有差异。随着基因工程技术的发展，已经有各种重组荧光素酶表达载体和表达产物应用于各研究领域，但从已有的报道来看，此类重组荧光素酶暴露在外界时会迅速失去活性，酶活性稳定性低，而且需要各种层析技术分离纯化，导致现有的萤火虫荧光素酶的制备方法步骤烦琐，耗时，操作麻烦。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新的萤火虫荧光素酶，该酶比自然提取到的荧光素酶或者重组的自然荧光素酶具有更高的酶活性稳定性，这是通过在自然的荧光素酶蛋白的N端加了一段氨基酸片断形成的，形成的融合蛋白称为AGG-Luc融合蛋白，这种新的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。

本发明的第二个目的是提供编码本发明的萤火虫荧光素酶的DNA分子，这是一种经密码子优化的萤火虫荧光素酶基因片断，称为Luc基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示，其编码的序列是从序列1的5’末端1-1632位核苷酸。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体以及将该重组表达载体转入宿主细胞得到的转化体，该重组表达载体包含编码萤火虫荧光素酶的DNA分子，该DNA分子以能够表达本发明的萤火虫荧光素酶的形式存在，这样该DNA分子导入到宿主细胞中得到转化体后，在加入适当的诱导剂的条件下，在转化体中按照需要表达蛋白。

作为一种优选的实施方式，该重组表达载体可为在pPLagg-1(苏州浦隆生物有限公司)的BamHI和HindIII位点间插入经过密码子优化的北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶基因(Luc基因)第1-1632位脱氧核糖核苷酸得到pPLagg-1-Luc。在pPLagg-1-Luc表达载体中，萤火虫荧光素酶基因位于高效启动子T7和乳糖操纵子下游，在beta-异丙基-巯基半乳糖苷(IPTG)存在时能被高效诱导转录，并翻译生成AGG-Luc融合蛋白。大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene公司)是一个合适的宿主，可以将pPLagg-1-Luc重组表达载体稳定地整合到其染色体组中，并受控于乳糖操纵子，因此大肠杆菌BL21(DE3)与pPLagg-1-Luc重组表达载体相容，在得到重组菌株BL21(DE3)后，经IPTG诱导得到重组AGG-Luc融合蛋白。大肠杆菌BL21(DE3)-pPLagg-Luc，可在含有蛋白胨、酵母提取物等的丰富培养基中生长，菌体产量大，蛋白表达率高。

本发明的第四个目的是提供一种萤火虫荧光素酶的制备方法，含有Luc基因的重组表达载体转化入宿主细胞后，得到含有该表达载体的转化体，经培养、诱导和纯化后得到重组AGG-Luc融合蛋白。重组表达的AGG-Luc融合蛋白在N端含有AGG蛋白，提高了表达产物的可溶性和稳定性，AGG蛋白可在高盐条件下沉淀，通过离心即可分离纯化重组AGG-Luc融合蛋白，该制备方法操作简单，省时，效率高。

本发明利用大肠杆菌偏爱密码子优化的萤火虫荧光素酶基因，构建重组表达载体pPLagg-1-Luc，转化入大肠杆菌BL21(DE3)得到工程菌株，利用高盐条件进行高效纯化，无需任何层析介质，制备方法快速高效，制得的萤火虫荧光素酶的酶活稳定性得到提高。