[发明专利]茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法

权利要求书

1.茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法，其特征在于：包括茶愈伤组 织诱导与继代、含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选、含不同儿茶素含量的茶细胞系筛 选、含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选4道操作步骤，具体操作方法如下：

(1)茶愈伤组织诱导与继代

A、诱导

选取茶树幼嫩茎为外植体，将外植体消毒，并接种于固体培养基上诱导，诱导条件： 温度25±1℃，暗培养；每21天转接继代一次，转接1-3次，茎段两端即可长出浅黄色的 茶愈伤组织；

B、继代

将浅黄色茶愈伤组织切成0.5cm*0.5cm大小，继续在固体培养基上继代培养，每21 天转接继代一次，至少转接5次，继代培养条件：温度25±1℃，暗培养；继代过程中不 断弃去褐化和长势不好的茶愈伤组织，保留生长速度快的茶愈伤组织；

(2)含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选

取茶愈伤组织在固体培养基上继代培养，21天转接继代一次；继代培养条件：温度 25±1℃，暗培养；在第21天转接继代时，采取目视法对茶愈伤组织进行筛选，即在超 净工作台上挑选不同颜色、不同质地的茶愈伤组织分别进行继代培养；转接继代半年至 一年，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织；

所述高儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为黄色、生长速度快、质地疏松；

所述低儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为白色、生长速度快、质地松散；

(3)含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天， 接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液 体培养条件：摇床转速100rpm、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种量1g， 温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，在超净工作台上将高儿 茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织逐一编号后用手术刀一分为二，取其中的一半放 入事先装有5ml1％g/v香草醛盐酸试剂的试管中，显色10分钟，将对应的另一半分别进行 继代培养；如此反复循环，至少4个循环，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶细胞 系；

所述高儿茶素含量的茶细胞系，1％g/v香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现深红色； 茶细胞系的儿茶素含量达到每克干重7.7689毫克以上；

所述低儿茶素含量的茶细胞系，1％g/v香草醛盐酸试剂活体快速显色后呈现浅红色； 茶细胞系的儿茶素含量达到每克干重0.1272毫克以下；

(4)含不同儿茶素组分的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天， 接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液 体培养条件：摇床转速100rpm/min、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种 量1g，温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，将高儿茶素含量 的茶愈伤组织的一半和低儿茶素含量的茶愈伤组织的一半分别进行儿茶素组分的薄层 层析检测，将对应的另一半分别进行继代培养；如此反复循环，至少4个循环；获得两 种以上含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系；

薄层层析检测操作步骤如下：

A.制备茶细胞系儿茶素提取液

对两种以上含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系分别制备茶细胞 系儿茶素提取液；

取含六种儿茶素组分和六种以下儿茶素组分的茶细胞系3g，加少许石英砂，液氮研 磨至粉碎，加3ml 95％乙醇研磨，4000g离心，吸取上清液，沉淀加3ml 95％乙醇，再次 离心，重复离心三次，最后95％乙醇定容至10ml；将上述得到的10ml乙醇溶液，蒸干 去除乙醇，再用热水溶解，再用与热水等量的乙酸乙酯萃取3次，取有机相浓缩干燥， 用1ml甲醇定容；甲醇定容溶液用孔径为0.45μm有机膜过滤，得两种以上儿茶素提取液；

B.薄层层析检测

分别对两种以上儿茶素提取液进行薄层层析检测；

薄层层析展开剂∶正丁醇∶冰乙酸∶水＝4∶1∶5，配制后的展开剂经过多次振摇后，放 置24小时后，弃去下层后待用；

将儿茶素提取液点样于2.5*10硅胶GF-254板上，25℃下展层2～3h，展开剂接近硅 胶板上端后取出硅胶板晾干，硅胶板经过1％g/v香兰素盐酸溶液喷雾显色，吹风机吹干 后，立刻观察拍照；

所述含六种儿茶素组分的茶细胞系，其儿茶素提取液，在展层后的硅胶板上，经过 1％g/v香兰素盐酸溶液喷雾显色，呈现四个红色条带；高效液相色谱检测含有表没食子 儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、儿茶素和 表儿茶素六种儿茶素；

所述含六种以下儿茶素组分的茶细胞系，其儿茶素提取液，在展层后的硅胶板上， 经过1％g/v香兰素盐酸溶液喷雾显色，呈现四个以下红色条带；高效液相色谱检测含有 表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子儿茶素、 儿茶素和表儿茶素六种儿茶素中的五种以下；

所述固体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg、 琼脂8g和蔗糖30g；pH为5.5；

所述液体培养基为：在1L B₅培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg、激动素0.1mg 和蔗糖30g；pH为5.5。