[发明专利]茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞系的筛选方法，茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方 法。

背景技术

植物类黄酮的合成受到外界环境因素的影响，光照、温度、营养等因素均会影响到 茶树中的酚类物质的合成。由于利用完整的茶树个体研究酚类物质的生物合成代谢有许 多限制因素，无疑茶愈伤组织和细胞悬浮培养体系已成为研究茶树次生代谢的良好平 台。筛选出含不同儿茶素含量及组分的茶细胞系是这种良好平台最终建立的前提。

常见的含特殊物质细胞系的筛选手段有多种，而寻找一种有效易行的特殊物检测手 段是筛选体系建立的基础。对于有颜色的特殊物，通常采用直接目视法筛选高产细胞系 ^[1]，如含花青素、萘醌、类胡萝卜素、叶绿素等物质的愈伤组织或细胞系，其颜色的深 浅表明了内含物含量的变化。山本等在筛选具有高产和稳产花青素细胞系过程中，利用 目视法挑选颜色较深的愈伤组织继代培养，这样反复筛选了近30代，在第23代之后细胞 块的色素含量的平均值保持稳定，并比原细胞株含量高7倍^[2]。吴蕴祺等利用二分法结合 高效液相色谱分析(HPLC)，对红豆杉愈伤组织中的紫杉醇高产细胞系进行筛选，获得了 一个紫杉醇高产细胞系Ts-19，其紫杉醇含量达细胞干重的4.0％^[3]。

但茶树儿茶素是无色的，无法通过肉眼直接进行茶细胞系的识别筛选，只能采取间 接的方法。儿茶素的含量可以通过1％香草醛盐酸试剂显色的分光光度法测定，儿茶素的 组分可以通过高效液相色谱(HPLC)法来检测，但其测定过程复杂、所需时间较长，如 从样品的儿茶素提取分光光度法测定至少需要30分钟，而从样品的儿茶素提取到高效液 相色谱分析完毕需要至少1小时，无法达到快速检测的目的，从而限制了含不同儿茶素 含量及组分的茶细胞系的筛选。

发明内容

为了解决茶树愈伤组织或细胞系中儿茶素含量及组分的检测所需时间较长，操作复 杂，无法达到快速检测的问题，本发明提供一种操作简便、可实现快速筛选的茶树含不 同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法。

具体技术方案如下：

茶树含不同儿茶素含量及组分的细胞系筛选方法包括茶愈伤组织诱导与继代、含不 同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选、含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选、含不同儿茶素组 分的茶细胞系筛选4道操作步骤，具体操作方法如下：

(1)茶愈伤组织诱导与继代

A、诱导

选取茶树幼嫩茎为外植体，将外植体消毒，并接种于固体培养基上诱导，诱导条件： 温度25±1℃，暗培养；每21天转接继代一次，转接1-3次，茎段两端即可长出浅黄色的 茶愈伤组织；

B、继代

将浅黄色茶愈伤组织切成0.5cm*0.5cm大小，继续在固体培养基上继代培养，每21 天转接继代一次，至少转接5次，继代培养条件：温度25±1℃，暗培养；继代过程中不 断弃去褐化和长势不好的茶愈伤组织，保留生长速度快的茶愈伤组织；

(2)含不同儿茶素含量的茶愈伤组织筛选

取茶愈伤组织在固体培养基上继代培养，21天转接继代一次；继代培养条件：温度 25±1℃，暗培养；在第21天转接继代时，采取目视法对茶愈伤组织进行筛选，即在超 净工作台上挑选不同颜色、不同质地的茶愈伤组织分别进行继代培养；转接继代半年至 一年，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织；

所述高儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为黄色、生长速度快、质地疏松；

所述低儿茶素含量的茶愈伤组织，颜色为白色、生长速度快、质地松散；

(3)含不同儿茶素含量的茶细胞系筛选

将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织分别接种到液体培养基上培养21天， 接着再分别接种到固体培养基上培养21天；固体培养条件：温度25±1℃，暗培养；液 体培养条件：摇床转速100rpm/min、培养瓶为150ml的三角锥形瓶、装液量30ml、接种 量1g，温度25±1℃、暗培养；在液体与固体培养的交替继代接种时，在超净工作台上 将高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶愈伤组织逐一编号后用手术刀一分为二，取其中的 一半放入事先装有5ml1％香草醛盐酸试剂的试管中，显色10分钟，将对应的另一半分别 进行继代培养；如此反复循环，至少4个循环，获得高儿茶素含量和低儿茶素含量的茶 细胞系；