[发明专利]山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，其特征在于含有丝状支原体山羊亚 种，拉丁文学名：Mycoplasma mycoides subsp.capri strain和绵羊肺炎支原 体，拉丁文学名：Mycoplasma ovipneumnoiae strain灭活抗原以及ISA206油 佐剂，采用以下方法和步骤制备而成：

a制苗用培养基及其制备方法：制苗用培养基为改良KM2培养基；

a.1培养基成分：最低要素培养基MEM占总量的50％，1.7％水解乳蛋 白Hank’s缓冲液占总量的35％，25％酵母浸液占总量的2％，健康马血清 占总量的10％，1％醋酸铊溶液占总量的1％，2万IU青霉素占1％，0.4％酚红 占总量的1％；

a.2培养基制备方法：将1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液、25％酵母 浸液、1％醋酸铊溶液和0.4％酚红经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入滤 过除菌的最低要素培养基MEM、健康马血清和青霉素，用1mol/L氢氧化 钠溶液调整pH值至7.4～7.8，无菌分装，2～8℃保存备用；

b增殖支原体的程序

b.1支原体的增殖：将丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体分别接种 改良KM2培养基，经3～5天培养，当培养物pH值下降至6.8～7.0时，按 培养基总量的5％进行3～5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.8～ 7.0时，收获支原体菌液，测定生长滴度并进行超滤浓缩；

b.2支原体的浓缩：用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使丝状支 原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液浓度均达到6.0～10.0×10⁸ccu/ml；

c.支原体灭活的程序

c.1灭活：给已浓缩的丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液分 别加入浓度40％的甲醛溶液，使菌液中甲醛的浓度达到0.2％，在37℃下各 持续灭活10小时，期间每2～4小时摇振1次，灭活终止，进行灭活检验；

c.2灭活检验：将灭活的支原体菌液进行抽样，各接种改良KM2培养 基2支，进行10倍系列稀释至10^-5，置37℃培养10日，均无支原体生长 者为灭活完全；

d.疫苗配制程序

采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗；

液相成分：丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按体积比 1∶1等比例混合后，按抗原总量的1％加入1％硫柳汞溶液；液相成分占疫苗 总量的45～50％；

油相成分：ISA206油佐剂，油相成分占疫苗总量的50～55％；

乳化方法：先将206油佐剂进料到均质机内，再将液相成分进料，循 环搅拌至充分混合，在36～38MPa压力下通过均质机，乳化成略带粘滞性 的水包油包水型(w/o/w)双相油乳剂灭活苗。