[发明专利]炭疽致死因子结构域(LFn)与炭疽水肿因子结构域(EFn)的融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明主要涉及生物技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其应用，尤其 涉及炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域(LFn)与炭疽水肿因子的保护性抗 原结合结构域(EFn)的融合蛋白及其用于炭疽毒素的中和。

背景技术

炭疽毒素包括两种A-B型毒素，每种都有不同的催化部分，既水肿因子(EF， edema factor)和致死因子(LF，lethal factor)。两个催化部分共享一个结 合的B部分，保护性抗原(PA，protective antigen)，结合后的完整毒素称为 水肿毒素(ET，edema toxin)和致死毒素(LT，lethal toxin)。炭疽对机体 的伤害主要是由于ET和LT的共同作用。ET和LT进入细胞发挥作用的过程如下： 首先是PA与细胞表面受体(ATR，anthrax toxin receptor)在细胞表面结合， 随后furin蛋白酶就将PA降解成20kD和63kD的两个组分。PA63在细胞膜表面形成 七聚体，炭疽致死因子和炭疽水肿因子结合在PA七聚体上，经过受体介导的内 吞进入细胞质与底物接触从而发挥其毒性作用。

根据以上的炭疽毒素进入细胞的机理，人们设计了不同的炭疽毒素抑制剂， 分别将毒素作用过程中涉及的不同分子作为靶标，从而阻断毒素的作用，保护细 胞免受毒素的攻击。

LFn是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域，负责致死因子与炭疽保护性 抗原的结合。LFn由炭疽致死因子的1-263位残基组成。EFn是炭疽水肿因子的 保护性抗原结合结构域，负责水肿因子与炭疽保护性抗原的结合。EFn由炭疽水 肿因子的1-254位残基组成。重组表达的LFn和EFn仍然具有结合炭疽保护性 抗原的能力，但对细胞无毒性作用。LFn和EFn能够与炭疽致死因子和炭疽水肿 因子竞争结合炭疽保护性抗原，具有作为竞争性毒素抑制剂的潜力。但实验显 示，它们的毒素抑制活性非常低。

发明内容

本发明的目的：在LFn和EFn的基础上，提供一种具有更强炭疽毒素抑制 (中和)活性的LFn与EFn的融合蛋白。

本发明的LFn与EFn的融合蛋白，包括炭疽致死因子的保护性抗原结合结构 域(LFn)和炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域(EFn)或上述二区的功能 同等物。

所述的功能同等物是指在不改变融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白部分氨 基酸的取代、缺失或添加所得到的多肽。

在本发明所指的融合蛋白中，可以是炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域 (LFn)的第一区位于融合蛋白的N-末端，炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构 域(EFn)的第二区位于融合蛋白的C-末端。也可以是炭疽水肿因子的保护性抗 原结合结构域(EFn)的第二区位于位于融合蛋白的N-末端，炭疽致死因子的保 护性抗原结合结构域(LFn)的第一区位于融合蛋白的C-末端。这两种情况对融 合蛋白的毒素中和活性没有太大的影响。

为了使融合蛋白的两部分尽可能的减少互相干扰，融合蛋白的两个部分之间 设置连接肽，连接肽的通式是(Gly Gly Gly GlySer)n，n为1-10的整数。 编码本发明融合蛋白的DNA序列及氨基酸序列。

该序列包括与炭疽致死因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同 的第一区和与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨基酸残基序列相同的第 二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与炭疽致死因子的保护性抗原结合结 构域氨基酸残基序列相同，第二区与炭疽水肿因子的保护性抗原结合结构域氨 基酸残基序列相同，中间设有(Gly Gly Gly GlySer)3连接肽的编码序列。 携带融合蛋白编码序列的重组表达载体(图1)和工程菌。

本发明的重组表达载体包括pET21a-LFnEFn及pET21a-27LFnEFn等。将上 述表达载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到工程菌BL21(DE3) -pET21a-LFnEFn和BL21(DE3)-pET21a-27LFnEFn。

本发明的应用。

本发明将LFn和EFn通过一段(Gly Gly Gly GlySer)₃的柔性Linker序列 融合在一起，构建的融合蛋白经过细胞保护实验和毒素攻毒的动物实验检测， 结果显示其具有的毒素中和活性较单体有很大的提高(图3)，可以有效中和炭 疽毒素的作用。

附图说明