[发明专利]一种用于基因治疗的新型细胞特异性内含microRNA结合序列的基因HAAVmir

说明书

技术领域：

本发明涉及基因治疗领域，具体而言，涉及一种新型的、细胞靶向特异性的、从源头彻底消除病毒衣壳蛋白复制与合成能力并清除其污染蛋白的基因片段及其在基础和临床医学上应用。

背景技术：

目前基因治疗临床试验用的载体仍然以病毒载体居多，占75％以上。其中，腺病毒(adenovirus)和逆转录病毒(retrovirus)载体占了大部分[许瑞安等，《分子基因药物学》，北京大学出版社&北京大学医学出版社，2008，北京]。病毒是在漫长的自然进化过程中存活下来的没有细胞结构的最小、最简单的生命寄生形式。在几千年的自然进化过程中，它可以找到最有效的途径进入人体。而病毒载体则利用了病毒天然的或改造的外壳和(或)外膜结构来装载目的基因。由于病毒本身是一种病原体，故对人体构成一定的安全隐患。目前，虽然基因治疗研究取得了可喜的进展，但仍有许多障碍有待克服，其中最主要的一个障碍是宿主对基因治疗载体和/或转基因产物产生的免疫反应。基因药物既可能引起固有性免疫反应，又可能引发适应性免疫反应。免疫反应常常导致基因表达效率下降，治疗不能持久，尤其再次使用相同载体时疗效更差，甚至产生严重的毒副作用。因此，为了实现基因治疗的长期疗效，必须设法降低免疫反应，诱导免疫耐受性。

腺相关病毒或称腺伴随病毒(AAV)属细小病毒科，为单链DNA，约4.7kb，能感染分裂期和非分裂期细胞，并能整合于宿主细胞染色体，可长期稳定表达。AAV的复制依赖于辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒等。AAV载体虽然不含病毒外壳蛋白基因，但病毒外壳蛋白可通过主要组织相容性复合体(MHC)II类途径将抗原递呈给CD4⁺T细胞。当其再次与机体接触时可激活B细胞，产生针对AAV的特异性中和抗体，明显抑制AAV载体介导的基因传递。如在免疫适能小鼠与恒河猴的实验中发现，肌肉注射AAV2载体的外壳蛋白可激活Th2细胞及B细胞，产生AAV2特异性的IgM及IgG。AAV载体除了能诱导T细胞依赖性的B细胞反应外，还可诱导T细胞非依赖性的B细胞反应。研究发现，通过脾脏将AAV载体输入到小鼠门脉循环可诱发部分T细胞非依赖性的B细胞反应，其持续时间比T细胞依赖性的B细胞反应要短。由AAV病毒外壳蛋白引起的体液免疫反应还与其使用剂量有关，降低载体剂量可大大减少体液免疫反应的产生。

最近的血友病基因治疗临床试验表明，在通过肝动脉途径给药后，AAV2外壳启动了CD8⁺T细胞介导的免疫反应，对转导了载体的肝细胞产生细胞毒作用，从而使有效的第九因子(FIX)表达只持续了8周，导致治疗失败。研究人员认为，患者曾经感染过AAV2，并在机体存在有针对病毒的记忆性CD8+T细胞，在接受基因治疗后，AAV2外壳激活了这些记忆性CD8+T细胞，导致含有AAV2载体的肝细胞被免疫系统清除[Halbert Clet al J Virol，1998.72(12)：p.9795-80]。

从靶组织内复制AAV颗粒(rcAAV)所合成的包装蛋白残余污染引发的危险性免疫反应长期存在，尤其在FIX表达对血友病临床治疗中，AAV颗粒(rcAAV)合成的包装蛋白引发的危险性免疫反应一直被广为关注。为了系统地减少含有潜在污染蛋白的rcAAV颗粒的影响，从源头彻底消除病毒衣壳蛋白复制与合成能力的研究，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。

本发明的目的是设计构建一种新型的、细胞特异性的、内含多个组织特异如肝特异(has-mir-122)和造血特异(has-mir-142-3p)序列拷贝的microRNA结合序列的基因片段，籍以控制包装蛋白基因片段表达，进而清除腺相关病毒包装蛋白污染诱发的AAV载体介导的免疫反应，以确保基因治疗能在临床取得成功。

发明内容：

本发明提供了一种病毒复制基因、包装蛋白基因和细胞特异靶向性microRNA序列组成的基因片段。其病毒复制基因，可以是AAV1型，AAV2型，AAV4型，AAV5，AAV8型，AAV9和其他类型AAV以及其他病毒的复制基因或非结构基因；其病毒包装蛋白基因，可以是AAV病毒包装蛋白基因，腺病毒包装蛋白基因，慢病毒包装蛋白基因或其它病毒包装蛋白基因；其细胞特异靶向性microRNA序列，可以选自肝细胞靶向性、肺细胞靶向性、造血细胞靶向性，或其他细胞靶向性的microRNA。

本发明提供的基因片段可直接导入肝细胞株，干细胞株，肺细胞株，肌肉细胞株或其他细胞株，也可用于构建重组腺相关病毒质粒和载体，用于基础研究和临床基因治疗。