[发明专利]一种改进的线粒体基因组全序列测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种改进的线粒体基因组全序列测定方法及其在测定线粒体基因组全序列中的应用。

背景技术

线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的、重要的细胞器.它是细胞进行氧化磷酸化的场所.人们把线粒体本身的遗传物质线粒体基因组(mtDNA)这一遗传信息系统归于真核细胞的第二遗传信息系统，或核外基因及其表达系统.对大量不同动物线粒体基因组全序列测定表明，动物线粒体基因由大致为15～20kb的双链环状DNA分子组成。线粒体基因编码着大约22个tRNAs，大小2个rRNAs和13个疏水性蛋白质多肽，这些多肽包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位：细胞色素b(Cytb)、2个ATP酶的亚单位、3个细胞色素c(Cytc)氧化酶的亚单位(CO I，II和III)、7个NADH还原酶复合体的亚单位(ND21，22，23，24，24L，25和26)(Lee and Kocher，Genetics.，1995，139：873-887；Gares，Genetics.，1998，118：649-663)。线粒体DNA的研究是近20年来分子生物学研究的重要课题之一，它引起人们的极大兴趣在于：

1、线粒体基因组不仅是研究DNA结构与DNA复制、转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成的一般问题的非常合适的模型系统(廖顺尧等，生物化学与生物物理进展，2000，27：508-512)。

2、线粒体基因组与核基因组在遗传信息表达上的相互关系是一个很重要的问题。线粒体基因组具有独立复制的能力，但是实现线粒体基因组复制与表达所需的许多酶(如DNA聚合酶、RNA聚合酶)却是由核基因组编码的(Anderson，et al.，Nature.，1981，290：457-465)。事实上，编码线粒体基因组的核基因数量大大超过了存在于mtDNA本身的基因数量，而mtDNA的遗传信息容量并不大，它的编码可能性只是核DNA编码容量的几万到几十万分之一，建立这种独立的线粒体遗传系统的机制本身使线粒体遗传显得极有意义。此外，线粒体基因向核基因的转座插入和复制，已作为分析转座机理、病毒转染的一个模型。线粒体基因组和核基因组的同源基因结构对比也被广泛地应用于核基因和核外基因进化研究中(Delarbre，et al.，Genetics.，1998，150：331-344)。

3、由于动物线粒体DNA(mtDNA)具有结构简单、严格的母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快且不同区域进化速度存在差异等特点，使其在种类鉴别和分类地位的研究方面及不同等级阶元系统发育的研究方面应用十分广泛。

目前，线粒体基因组全序列测定的研究方法主要有三种。

1、基于物理分离策略的方法

在PCR技术引入线粒体DNA(简称mtDNA)分离以前，对于线粒体基因组全序列的测定，主要包括(1)高纯度mtDNA的获得；(2)mtDNA片段化成适于克隆测序的短DNA片段2部分内容。高纯度mtDNA的获得，主要有氯化铯密度梯度离心法(Lansman，et al.，J Mol Evol.，1981，17：214-226)和差速离心法(闫华超等，生物技术通讯，2007，18：95-97；Tamura and Aotsuka，Biochem Genet.，1988，26：815-819)。此外，还有在此基础上进行局部优化的方法，如DNase法、碱变性法和改良的碱变性法等(闫华超等，生物技术通讯，2007，18：95-97；夏玉玲等，蚕学通讯，2002，22：24-29)；mtDNA片段化通常用限制性内切酶消化或超声波随机打断2种方法将mtDNA片段化为适合克隆测序的短DNA片段。但是，需要昂贵的设备，实验时间较长，尤其是对实验材料消耗较大。

2、基于LA-PCR技术的方法