[发明专利]孢子纲物种体外培养的方法及其用途

说明书

本申请是申请号为03811387.2，发明名称为“孢子纲物种体外培养的方法及其用途”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及孢子纲(Sporozoea)及其种属的成孢子囊原生动物连续培养的培养体系和方法。本发明还涉及用本发明的培养体系和方法制成的裂殖子和卵囊及相关孢子纲生命阶段细胞，供疫苗、检定和其他用途之用。

发明背景

孢子纲原生动物包括成孢子囊原生动物，其中许多是导致全世界人和动物疾病的病源。其中有着特殊的商业联系的是由孢子纲的球虫亚纲(Coccidia)、真球虫目(Eucoccidiida)和艾美球虫亚目(Eimeriina)引起的疾病，以及由成孢子囊原生动物的囊等孢虫属(Cystoisospora)、艾美球虫属物种(Eimeria)、等孢子球虫属(Isospora)、新孢子虫属(Neospora)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、弓浆虫属(Toxoplasma)、泰泽属(Tyzzeria)和温扬球虫属(Wenyonella)引起的疾病。

特别是，球虫病是由球虫亚纲、艾美球虫属物种原生动物寄生虫引起包括家畜如家禽在内的动物所患的一种伤寒疾病。这些专性细胞内原生动物寄生虫主要在肠上皮复制。此类寄生虫具有单宿主的生活周期并展现出高度的宿主性和组织特异性。总的说来，由于球虫病和预防药物费用的综合损失，受其影响的工业每年蒙受重大的经济损失。

家畜球虫病传染的经济影响在养鸡业中体现得尤为严峻，因为养鸡业密集的禽舍会加快疾病的传播。球虫亚纲感染使得禽类例如家禽及其他驯养的鸟类生长迟缓和表皮色变从而造成经济损失。另外，多数艾美属球虫可以经由口腔途径和/或从环境吸入传染的微粒感染单宿主。一旦吸入，寄生虫穿透并损害肠壁粘液层而引起急性发病，例如，导致受感染的禽类生长缓慢和饲料利用性降低。

艾美球虫属物种、等孢子球虫属、囊等孢虫属或隐孢子虫属(Cryptosporidium)原生动物仅需要单宿主即可完成它们的生命循环。在自然条件下，从环境摄取形成孢子的卵囊开始生命周期。摄取成孢子的卵囊的细胞壁被胃机械破坏和/或肠酶消化而破碎。生物体感染期的孢子体在孢子囊内。孢子体侵入肠粘膜或其他位置的薄壁细胞。该感染位置是所包含种属的特征。

在宿主动物的细胞内，孢子体发育成也被称作裂殖体的多核分裂体。各分裂体核成长进入被称作裂殖子的感染体，也就是进入新的细胞并重复该过程。在无数的无性世代以后，裂殖子发育成为小配子母细胞或大配子。小配子母细胞发育成能依次使大配子受精的许多小配子。最终的合子通过形成坚韧的细胞外膜包在囊内，然后被称作卵囊未成孢子就脱落在排泄物中。在适当的环境下，卵囊发育成孢子并可以传染。通过易感的动物传染然后重复该循环。

球虫亚纲传染引起一种特异性免疫。例如，有七种已知的球虫亚纲可以感染雏鸡，其中六种被认为能使之从普通状态到急性发病。

因此，在驯养的鸟类中，引入另外的球虫亚纲或以前未出现的鸟类可以导致该疾病的爆发。卵囊能最大限度防御PH、去垢剂、解朊、酵解、脂肪分解酶、机械破坏(尽管它们可以被实验室的方法破坏)和例如次氯酸钠和重铬酸钾的化学制品，并可在宿主外部存活多个星期。例如，有七种已知的球虫亚纲可以感染雏鸡，其中六种被认为能使之从普通状态到急性发病。

多种方法被用来使家禽对球虫亚纲免疫。所有成功的商业方法均是基于对被包在囊内通常带减毒株的活原生虫给药。尽管已经习惯使用其他途径，但最常规的接种途径还是口服。在美国专利US3,147,186中，Edgar指出可以通过口服给药能存活的柔嫩艾美球虫(E.tenella)成孢子卵囊让雏鸡接种疫苗。在美国专利US4,544,548中，Davis等教导一种不管抗球虫药物是否联合给药而通过连续给药少量成孢子的卵囊接种疫苗的方法。

在雏鸡体内可以通过连续传代完成减毒美国专利US5,055,292已经描述了卵囊早期形成的球虫亚纲株系的选择和减毒，该文献在此引入作为参考。

口服给药孢子囊减毒株也被应用于预防球虫病的交互免疫性。[Shirley的美国专利US4,438,097；McDonald的美国专利US5,055,292和Schmatz等的PCT.WO94/16725]。在Jenkins等Avian Dis.，37(1)：74-82(1993)中公开了减毒的另一种方法，它教导用γ辐射处理的孢子体口服给药以防止卵片发育。