[发明专利]一种检测传染病病原体的方法及便携式检测装置

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及检测传染病病原体的方法及便携式检测装置。

背景技术

在传染病流行的初期，准确、快速、便捷地对传染病的病原体进行检测，是控制传染病流行的关键。虽然国内和国际上已经建立了传染病的监测系统，但是现有的检测手段各有局限性。

血清学检查利用相应的抗体与抗原结合检测到病原体，此方法诊断快速，简单、易于操作，但必须制备出针对该病原体的抗体后才能够进行检测，尤其是在还没有抗体来源的情况下不适用于传染病的早期诊断。

病原体分离法是通过直接对病原体进行分离培养，检测鉴定病原体。此方法灵敏度高、特异性强，但操作复杂、费时(至少要花费一周时间)，对实验室生物安全条件要求非常高，所以很难在疫情发生现场采用，而且不是所有的病原体都能通过病原体分离法获得。

核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量PCR(Real time PCR)，灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在DNA污染造成的假阳性率高的问题，而且由于其临界值不明显，因此检测结果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求高，投入大，对操作人员要求高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该方法对于病原体含量极低的样本仍然无法检测。

NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA，依赖核酸序列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术的反应体系包括反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶和两条特别设计的寡核苷酸引物，其上游引物3′末端与模板的3′末端互补，5’末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列.在扩增起始阶段，上游引物与正义RNA模板结合后，在反转录酶的作用下合成与靶标RNA互补的反义cDNA，而原来的的RNA模板则被RnaseH降解。接着下游引物与cDNA杂交，在反转录酶的DNA聚合酶特性的作用下合成双链cDNA，即对应靶标RNA的双链cDNA拷贝。由于双链cDNA一端包含有T7RNA polymerase的启动子序列，从而诱导了RNA聚合酶的活性，合成大量的与靶标序列互补的反义RNA链。如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。

利用染料Gelred、EB、Calcein和MgCl2的特性检测NASBA特异扩增产物。Gelred和EB作为核酸染料通过紫外激发观察荧光，NASBA扩增过程中产生的大量焦磷酸盐副产物与Calcein竞争结合Mn²⁺而发荧光，MgCl₂先直接和焦磷酸盐作用产生絮状沉淀.通过观察荧光或沉淀来检测NASBA扩增产物，判断病毒模板的感染情况。以此来检测此方法操作简单，结果表现直观，适用于样品的快速检测。

流感病毒A亚型主要通过呼吸道传播，发病急，传染快，致病性高并且难以与普通感冒区分，极易延误诊断和治疗的最佳时机。目前尚未见报道快速直观能检测及鉴别流感病毒A亚型传染病病原体的检测方法，也没有相应的便携式检测装置上市。其它可以应用此方法进行的传染病病原体诊断还包括禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H7亚型、SARS冠状病毒、汉坦病毒，耶氏鼠疫菌和炭疽杆菌等。

发明内容

本发明目的是克服现有技术不方便携带，不能直接观察结果的缺陷，提供一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，所述传染病病原体为流感病毒A亚型，包括：

(i)扩增生物样品的核酸片段，所述核酸片段为流感病毒A亚型基质蛋白1基因如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；

(ii)用染料Gelred、EB、Calcein、MgCl₂进行检测.

本发明还提供步骤(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示：引物用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

本发明还提供所述步骤(ii)使用的染料，包括Gelred、EB、Calcein或MgCl₂的一种。

本发明所用仪器如迷你离心机、恒温仪、酶标仪等都可使用普通电源、蓄电池或干电池作为整套装置所需的能源。

上述方法的结果处理可以采取如下方案：测试K个阴性对照样品和阳性样品，比较它们的荧光是否出现或沉淀的多寡，出现荧光或出现浑浊即判断为“阳性”。