[发明专利]一种基因重组人铁蛋白轻链的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因重组人铁蛋白轻链的制备方法。

背景技术

临床医学的发展对检验结果的准确性、稳定性和敏感性要求越来越高，因此高质量的质控品、校准品和参考品是检验诊断中的关键产品。目前我国基本是应用第一代和第二代组织纯化的铁蛋白产品，其活性、线性、稳定性、特异性、敏感性、保存时间等均由于来源的不确定性而差异很大。因此，基因重组方法迅速应用并推动此类产品进入第三代。由于铁蛋白结构复杂，24个亚基单位的共同复性极其困难，要获得最小检测限、高效价、大范围线性要求的基因重组铁蛋白标准品的技术性很高。因此，我国目前尚无基因重组铁蛋白标准品。

由于铁蛋白与炎症病变、血液病、肝病、心脑血管疾病、肾病以及恶性肿瘤等密切相关，在这些疾病的临床诊断、治疗、监测中都起到重要的作用。因此，研究为保证检验质量研发不受来源的限制、性质稳定、批间差异小、使用成本较低的具有我国自主知识产权的基因重组铁蛋白标准品迫在眉睫。特别是目前临床上使用的铁蛋白检测方法多种多样，各种方法之间的一致性难于比较。国内专家早已呼吁构建我国自己的铁蛋白参考品，以期真正解决铁蛋白测定的准确性和可比性。本研究设计了一种将铁蛋白轻链(Ferritin L)在大肠杆菌中表达的方法，经测序及Westernblot鉴定，证实具有良好的抗原性。现将结果报道如下。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种基因重组人铁蛋白轻链的制备方法。为生产纯度好、稳定、易储存和运输的铁蛋白参考品建立基础。

为解决上述技术问题，本发明所提供的技术方案是：

本发明提供一种基因重组人铁蛋白轻链的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用RT-PCR技术从人血细胞中获得人铁蛋白轻链基因片段；

(2)将步骤(1)中PCR获得的人铁蛋白轻链基因片段亚克隆到pGEM-T载体上，转化感受态Top10细菌，然后接种于含氨苄青霉素的LB培养基，筛选阳性克隆菌株，提取阳性克隆菌株的质粒pGEM-T/ferritin L，并进行测序鉴定。

(3)以步骤(2)中的质粒pGEM-T/ferritin L为模板，进行PCR扩增，然后对扩增产物进行双酶切，同时将空质粒pET-30a进行双酶切，分别回收并纯化酶切产物，用T4连接酶连接，获得表达载体，转化感受态大肠杆菌，然后接种于含卡那霉素的LB培养基，筛选阳性克隆菌株，提取阳性克隆菌株的表达质粒pET-30a/ferritin L，并进行测序鉴定。

(4)用IPTG诱导蛋白表达，纯化铁蛋白轻链。

其中，步骤(3)中所述大肠杆菌为BL21或DE3。

步骤(3)中所述双酶切为用NdeI和BamHI进行双酶切。

本发明具有的优点：目前，我国铁蛋白国家标准品还是靠提纯获得。铁蛋白参考品的研制，可以解决我国目前铁蛋白参考品长期依靠进口的弊病，可以建立我国的标准物质，并为建立和完善铁蛋白检测的溯源体系打下基础；为今后提高临床铁蛋白检测的准确性、一致性和可靠性提供保证，同时为提高我国铁蛋白测量值在国际上的可比性、等效性起到重要的作用。本发明是运用基因重组的方法，分别表达出铁蛋白的轻链，并对所得到的蛋白进行初步分析鉴定，确定铁蛋白基因重组参考品研发的可行性，并为临床其它参考品的研发提供了新的思路。

附图说明

图1pET-30a/ferritin L基因扩增产物电泳图。(1DNA marker；2pET-30a/ferritin L PCR产物)

图2pET-30a/ferritin L SDS-PAGE电泳图。(1蛋白marker；2pET-30a/ferritin L表达产物)

具体实施方式

下面采用具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

菌种和质粒

感受态大肠杆菌Top10购自Tiangen公司；pGEM-T克隆载体试剂盒购自北京赛百盛公司；大肠杆菌BL21(DE3)菌株和表达载体pET-30a购自Novagen公司。

主要试剂

Taq DNA聚合酶及引物购自北京赛百盛公司；质粒小量提取试剂盒、总RNA提取试剂盒以及RT-PCR试剂盒购自北京Tiangen公司；限制性内切酶购自NEB公司；和T4连接酶等工具酶购自北京赛百盛公司；DNA回收试剂盒购自Tiangen公司；鼠抗人Ferritin L单克隆抗体购自Santa cruz公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自赛驰生物；其它试剂均为国产或进口分析纯。