[发明专利]利用藻类Chlorella vulgaris生产用于治疗感染的抗菌肽

权利要求书

1、一种用高效、大量、无污染的方法生产的抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。其特征在于利用分子生物学技术，采用具有独立自主知识产权的藻类水生植物特异性表达的技术平台，以藻类Chlorella vulgaris为生物反应器，利用藻类特异性表达的启动子，在藻类中高效表达具有生物活性的重组抗菌肽。

2、根据权利要求1所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法。其特征在于，所述利用以藻类Chlorella vulgaris生产用于治疗感染的抗菌肽的主要步骤：

(1)在藻类表达系统中生产重组抗菌肽

为了能在以藻类Chlorella vulgaris中表达抗菌肽，先将人β防御因子(hBD-3)和Cap18的cDNA序列连接到表达载体上，以便将其用于对藻类组织的感染。随后把经PCR扩增的抗菌肽编码序列插入到表达载体中，构建重组质粒Amp-表达载体。将以藻类Chlorella vulgaris转接到组织培养平板中的同时，将构建好的重组质粒转化到农杆菌。在卡那霉素存在的条件下培养5-10天后，转基因的藻类开始生长。初步检测转基因的藻类是否具有一定的抗菌活性。

(2)纯化重组抗菌肽

我们会预先在蛋白的C末端添加His-tag以便检测抗菌肽是否表达，以及纯化过程中也能使用该标签达到最好的效果。纯化工具使用Maxi His-tag纯化柱(USB公司)，纯化方法则完全按生产商提供的标准程序进行。纯化出来的抗菌肽蛋白进一步用Western blotting的方法加以确认，His-tag抗体来源于USB公司。如果需要纯度更高的蛋白用于检测其抗菌活性，则使用高效液相色谱的方法。

3、根据权利要求2中所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法，构建重组穿梭质粒Amp-表达载体，其特征在于抗菌肽基因与高效穿梭载体连接，并用于转化农杆菌。

4、根据权利要求2中所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法，构建重组穿梭质粒Amp-表达载体，其特征在于将人β防御因子(hBD-3)和Cap18的cDNA序列连接到表达载体上。