[发明专利]利用藻类Chlorella vulgaris生产用于治疗感染的抗菌肽

说明书

技术领域

本发明涉及抗菌肽的生产方法。具体来说，本发明利用藻类这种水生植物成本低、无污染、数量大的优点，开发藻类真核生物表达系统Chlorella vulgaris，用于大量生产抗菌肽，并将具有极强非特异性的生物活性分子抗菌肽用于治疗细菌或真菌感染，尤其是那些因为过度使用抗生素而产生耐药性的病原。

背景技术

抗菌肽是一种在自然界分布极为广泛、微生物和多细胞生物都可以合成的生物活性分子。这使得抗菌肽很自然地成为生物体抵抗病原的第一道防线，并且与其非特异性免疫相关联。由抗菌肽在生物组织中的不同分布，它们确保生物体能全面或在局部地区抵抗环境中的病原。大多数抗菌肽为带正电荷的分子，有20-50个氨基酸，并且具有两性结构，如alpha-螺旋，发夹式折叠，beta-折叠，或者alpha-螺旋/beta-折叠混合结构等，而这些结构则可能是抗菌肽具有抗菌活性的关键。这些抗菌肽展现了有效的抗菌活性，特异性很小，因此能抑制很多各种各样的细菌和真菌，包括口腔病原。抗菌肽主要被分为三种：1、具有α-螺旋构象的多肽(昆虫抗菌肽、magainins等)；2、具有一对半胱氨酸残基的环状和开放末端环状多肽(defensins、protegrin等)；3、特定氨基酸含量高的多肽(富含脯氨酸、富含组氨酸等)。

过去几十年，随着抗生素的广泛应用，持续进化的抗药物微生物，以及有可能出现的“末日审判”微生物，如MRSA、VRE，被越来越多地关注。然而，由于抗菌肽在生物活性(像亲水脂分子一样插入细菌细胞膜，在膜上产生的孔道能导致细菌细胞渗透性裂解)上具有非特异性，使得那些对抗生素具有抗性的细菌对抗生素仍旧是敏感的。因此，作为天然的抗菌物质，抗菌肽可以作为一种新的药物用于治疗。然而，由于无法生产大量具有生物活性的分子，限制了将抗菌肽用于抗感染治疗。

近年来，水生生物由于其易于大量聚集和作为新能源潜在资源的特性，吸引了广泛的关注。同样，由于其生产成本低、无污染和数量大的特性，使水生生物作为表达系统生产抗菌肽成为可能。在研究过程中，我们使用普通的藻类(Chlorella vulgaris)作为“抗菌肽原型大量表达系统”生产两种重组抗菌肽，并且证实水生生物表达系统能用于生产足够的抗菌肽，用于科研活动和未来可能商业性抗菌肽治疗人或动物的感染，尤其是口腔感染。

藻类分布的范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强，在只有极低的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。不仅能生长在江河、溪流、湖泊和海洋，而且也能生长在短暂积水或潮湿的地方。从热带到两极，从积雪的高山到温热的泉水，从潮湿的地面到不很深的土壤内，几乎到处都有藻类分布。以小球藻为例，小球藻是一种单细胞真核绿藻，作为生物反应器可对复杂蛋白进行正确的翻译后加工，形成有活性的分子；同时又具备微生物的特点，生长繁殖迅速，培养条件简单，生产成本相对低廉，易于大规模培养；对其基因组结构与功能的研究也口益深人，因而小球藻是进行基因工程研究的较理想材料。水生生物是一组具有巨大生物技术潜力的生物，因为它们有低成本和数量大的优点。在每平方英里地域上，藻类的数量大概是其它作物(如玉米)的30倍。由于可以进行光合作用产生能量用于代谢，大多数藻类可以在非常简单的环境(水、碳源、光照)中生长。同样，藻类可以作为新的生物反应器用于生产生物活性物质。农杆菌中介使基因稳定转化的藻类表达系统可以作为潜在的高效表达系统，因为其具有如下优点：1、载体可以将外源基因整合到藻类细胞中；2、可以获得稳定转化的转基因藻类；3、转基因藻可以很快生长到很大的数量；4、真核生物藻类可以进行糖基化修饰。

发明技术内容

本发明的目的是提供一种高效、大量、无污染的方法来生产抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。其特征在于利用分子生物学技术，采用具有独立自主知识产权的藻类水生植物特异性表达的技术平台，以藻类Chlorella vulgaris为生物反应器，利用藻类特异性表达的启动子，在藻类中高效表达具有生物活性的重组抗菌肽。克服了重组抗菌肽的表达量低、可溶性差、无生物活性和纯化工艺难等技术问题，为实现重组抗菌肽的规模化生产提供了可能。上述的藻类是指藻类，Chlorella vulgaris和其他常见藻类，也可以是其他不常见藻类。

本发明将公开利用藻类Chlorella vulgaris生产用于治疗感染的抗菌肽的方法。所述利用藻类Chlorella vulgaris生产用于治疗感染的抗菌肽的主要步骤：

1、在藻类表达系统中生产重组抗菌肽