[发明专利]一种恶臭假单胞菌株及其在制备羟基乙酸中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种恶臭假单胞菌株，以及酶法制备羟基乙酸的方法。

背景技术：

羟基乙酸(乙醇酸)是一种重要的中间体，广泛用于日用品、工业清洗 剂、聚合物的单体及医药领域等。传统制备羟基乙酸的方法是通过化学合成， 但通常化学合成需要高温、高压，且纯度难以满足需求。目前工艺较为成熟的 化学法制备羟基乙酸的方法主要有氯乙酸碱性水解法。但该方法存在的缺陷是 反应效率低、产物容易产生聚酯或者交酯等问题。生物法制备羟基乙酸受到普 遍关注，主要有腈水解酶水解羟基乙腈法和乙二醇不对称氧化法。这些方法所 使用的原料羟基乙腈和乙二醇都较贵，且羟基乙腈和制备过程中使用的氢氰酸 都是剧毒品，因此用来生产羟基乙酸具有一定的限制。

卤代乙酸脱卤酶是一类可以水解氯乙酸的酶，该酶来源广泛，已经在假单 胞菌属、根瘤菌属、伯克霍尔德菌属等发现。卤代乙酸脱卤酶目前主要用于污 水或工业废水中的氯乙酸的环境治理，至今没有人用来生产制备羟基乙酸。因 此开发从氯乙酸酶法制备羟基乙酸的方法，一方面可以在治理环境中变废为 宝，也可以用来直接以氯乙酸为原料制备羟基乙酸。

发明内容：

本发明所解决的技术问题是提供一种新的恶臭假单胞菌株及其在制备羟基 乙酸中的应用。

发明人首次分离纯化到一株能快速降解氯乙酸的菌株。经过16S rRNA和生 理生化鉴定，该菌株为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)，命名为恶臭假 单胞菌CA15(pseudomonas putida CA15)。该菌株保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理中心，保藏日期为2009年9月7日，保藏号为CGMCC No.3267。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：该菌株为恶臭假单胞菌株 CA15，菌种保藏号为CGMCC No.3267。

本发明的恶臭假单胞菌株CA15为生物催化剂的应用，以用于制备羟基乙 酸。

本发明使用恶臭假单胞菌株CA15制备羟基乙酸的方法是主要包括如下步 骤：

(1)添加诱导剂对恶臭假单胞菌CA15进行诱导培养，离心获得细胞或者在 获得细胞后进一步经过破胞提取粗酶；

(2)以获得的静息细胞或者粗酶液为催化剂，在缓冲溶液中添加氯乙酸盐 作为底物进行反应，然后从反应液中收集羟基乙酸。

进一步地，本发明在步骤(1)中，所述诱导培养的培养条件如下：所述 诱导剂为10～70mM的氯乙酸钠；培养温度为20～50℃。

进一步地，本发明所述培养温度为25～40℃。

进一步地，本发明在进行诱导培养时还添加辅助碳源，所述辅助碳源为 0.5～10g/L的蔗糖或甘油。

进一步地，本发明在步骤(2)中，所述缓冲溶液的pH为5～11，反应温 度为20～50℃。

进一步地，本发明所述缓冲溶液的pH为8～10，反应温度为25～35℃。

本发明的恶臭假单胞菌CA15(pseudomonas putida CA15)在发酵培养基 中添加诱导剂氯乙酸钠诱导培养，离心获得细胞或者进一步经过破胞提取粗 酶。

以获得的静息细胞或者破胞粗酶液为催化剂，在缓冲溶液中，通过一次或 多次添加氯乙酸钠，然后从反应液中收集羟基乙酸。

与现有技术相比，本发明的优点有：

(1)采用新的酶法，水解氯乙酸获得羟基乙酸，在环境治理中，可以 变废为宝。

(2)相比于化学碱性水解氯乙酸制备羟基乙酸，本发明工艺简单，反 应条件温和，且产物纯度高，可以达99％以上，满足大多数的医 药需求。

(3)发明所使用的原料氯乙酸相比于羟基乙腈，价格较低，来源广泛， 具有较大的经济价值。

(4)恶臭假单胞菌CA15具有较强的脱卤能力，制得的粗酶活力高。

附图说明

图1是羟基乙酸和氯乙酸的高效液相分析的标准谱图；

实验分析条件如下：Agilent 1100系统，有机酸分析柱Bio-Rad HPX- 87H(30cm×7.8mm)，流动相为5mM硫酸水溶液，流速为0.6ml/min，室温 下测定紫外(UV)210nm下吸收值；氯乙酸和羟基乙酸在此条件下的保留时 间分别为15.392min和12.154min。