[发明专利]同时检测对虾WSSV和IHHNV的方法及所用检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及水产动物病原检测技术，具体是对虾白斑综合症及传染性皮下及造血组织 坏死病毒的核酸多重等温扩增检测试剂盒及检测方法。

背景技术

对虾白斑综合症病毒WSSV最早出现在上世纪90年代初，是一种具有高度感染性和 致死性的病毒，是危害全球对虾养殖业最主要的病毒。WSSV能感染广泛的宿主，包括所 有种类的对虾和其它大多数甲壳类动物，甚至在昆虫体内也有发现，而且还能垂直传播。 对虾被感染后表现出非常高的死亡率，累积死亡率通常在观察到第一次明显的感染迹象后 3-10天达到100％。

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)最初在夏威夷地区养殖的细角滨对虾 (Litopenaeus stylirostris)中被发现，分布广，危害严重，引起死亡率高达90％以上(Lightner et al，1983)，而且可感染世界各地养殖对虾，是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾 病之一，对世界对虾养殖事业发展影响重大。在可感染南美白对虾(Penaeus vannamei)的 多种病毒中，IHHNV可导致慢性矮小残缺综合症(Runt-deformity syndrome，简称RDS)， 虽不会导致对虾大量死亡，但是病毒感染实际上会造成经济上的重大损失。感染IHHNV 的南美白对虾，畸形率高，个体成长差异性大，饵料效率差，商品价值低，产量偏低，整 体养殖经济损失可能高达50％。研究发现感染传染性皮下及造血组织坏死病毒或患病后存 活下来的南美白对虾会终生带毒，并可通过垂直和水平传播方式把病毒传给下一代和其他 种群。

对于对虾病毒性疾病，目前还没有有效的药物进行治疗，生产上多以预防为主，所以 病毒病原的检测，特别是早期的检测显得格外重要。

目前，有关对虾病毒的检测方法主要有五种，第-种是电镜观察法，第二种是HE染 色法，第三种是抗体检测法，第四种是核酸探针杂交法，第五种是PCR检测法。电子显 微镜技术虽然可以直观察到病毒粒子的存在，但操作复杂、耗费时间长、成本高。HE染 色法基于病理学技术，不能直接对病毒进行检查，只能利用发病的组织病理征兆进行检测； 抗体检测法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，其检测灵敏度 较低，耗时较长，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测，对于尚未引发感染或在 感染的极早期很难用以上的方法检测；PCR检测法，虽然克服了前四种方法的缺点，在实 验室条件下能实现对病毒的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR 仪、凝胶电泳和成像系统，且检测时间稍长，也大大限制了PCR检测方法在生产实际中 的推广应用。

近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP)，该方法可以高灵敏地非常有选择性地 高效扩增靶序列，最终的LAMP产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花 椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱。 LAMP是一种新型的恒温核酸扩增方法，和其它核酸扩增技术相比，其反应原理、引物设 计更加复杂。但是它具有等温扩增：只需要一个恒温装置就可以；高效灵敏：模板仅需要 10个拷贝或更少；扩增特异性强：应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增； 检测时间短：扩增可以在60min完成，比普通PCR反应要省时间；产物可以通过直接在反 应管中加荧光染色或用琼脂糖凝胶电泳检测。以LAMP为基础发展而来的多重环介导等温 扩增法(multi-LAMP)可以实现在同一反应体系中一步同时检测多种靶基因，同LAMP一步 反应只能检测一种靶基因相比，节省了检测步骤和检测时间。

鉴于目前在对虾养殖或相关产品的进出口贸易中经常出现多种病毒混合感染的状 况，如WSSV和IHHNV等病毒混合感染南美白对虾，开发一项对多种病毒同时进行一步检 测的多重环介导等温扩增技术显得非常迫切和急需。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测灵敏度高且易操作的对虾WSSV及IHHNV 同时检测的方法以及配套的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时检测对虾WSSV和IHHNV核酸多重等温 扩增检测试剂盒，该试剂盒包括：

(1)、研磨液管：内装研磨液；

(2)、核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液；

(3)、核酸提取液B管：内装无水乙醇；

(4)、核酸提取液C管：内装质量浓度为70％的乙醇；