[发明专利]提高骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的培养方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种促进模拟微重力环境条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的培养方法。这种方法能有效地逆转模拟微重力环境条件对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的抑制作用，提高定向分化成骨细胞的能力。 

(二)背景技术

太空的微重力(失重)环境严重造成了宇航员的骨量丢失。长期的太空生活使得宇航员发生类似于老年性骨质疏松的骨形态变化。目前已发现，这种骨形态变化与骨细胞发育和功能异常有密切的联系。同时，骨髓腔内成骨细胞生成减少，而脂肪细胞大量增加，说明其共同祖先骨髓间充质干细胞的分化潜能发生了转向，即向成骨细胞分化的能力降低，而向脂肪细胞分化能力增强。所以，研究造成这种分化转向的分子机理，寻找关键的细胞信号分子，并针对关键细胞信号分子采取相应的分子调节技术，以逆转这种微重力生物学效应，将对预防和治疗宇航员的骨形态变化、乃至老年性骨质疏松，开发新的药物，具有重要的技术意义和开发价值。 

由于空间实验环境有限，因此目前许多空间环境生物学效应的实验是采用地基模拟方法。当前为国内外普遍接受的模拟微重力效应的方法是采用美国航天局(NASA)技术专利的RWV生物反应器(SyntheconRCCS-4DQ)。该反应器在低速旋转下，其培养器内含有携带细胞的微载体随着培养液以培养器同样的转速旋转，使得细胞因所受重力矢量的随机变化而呈悬浮状态，在培养液中进行自由落体运动，达到了模拟微重力效 应的目的。 

本申请发明人前期通过上述模拟微重力实验，发现在模拟微重力环境抑制了骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力，提升了向脂肪细胞分化能力。分析造成这种分化转向的分子机理，确定出成骨细胞和脂肪细胞分化相关细胞分子信号转导途径中的一些激酶和转录因子的表达和活性水平变化是导致这种分化转向的关键细胞信号分子。这些关键细胞信号分子中，与成骨细胞分化相关的激酶ERK和转录因子Runx2的表达水平和活性水平都降低，而与脂肪细胞分化相关的激酶P38和转录因子PPARγ的表达水平和活性水平都上升。由此确定，模拟微重力环境导致骨髓间充质干细胞的这种分化转向是由相关的关键细胞信号分子表达和活性水平发生变化所致。 

然而，针对上述模拟微重力环境导致骨髓间充质干细胞分化转向的分子机理以及关键细胞信号分子，采用相关的小分子化合物以及药物等调节关键细胞信号分子的表达及活性水平，逆转模拟微重力环境导致的这种分化失调，提高骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力，适当降低向脂肪细胞分化的能力。因此，设计模拟微重力环境下骨髓间充质干细胞定向诱导分化的培养方法，逆转模拟微重力环境导致的这种分化失调，不但对将来进行太空环境下的干细胞分化实验研究具有指导意义，同时对今后开发航天员骨形态变化以及老年性骨质疏松症的预防和治疗药物具有重要的实际应用意义。 

(三)发明内容

本发明基于影响骨髓间充质干细胞分化转向的关键细胞信号分子ERK、P38、Runx2和PPARγ的表达和活性水平，判断4种信号分子的表达水平变化与其基因及其调控区组蛋白的表观遗传特性改变有关，而2 种转录因子Runx2和PPARγ的活性是分别受其上游蛋白激酶ERK和P38控制的。为此，本发明的焦点是通过小分子化合物或相关药物，增强ERK的活性和Runx2的表达水平，降低P38的活性而抑制PPARγ的磷酸化，从而达到提高成骨细胞特异性基因表达和适当降低脂肪细胞特异性基因表达的目的。 

本发明采用的技术方案是： 

一种提高模拟微重力环境下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的培养方法，所述方法包括：将稳定传代(通常为第3代)的骨髓间充质干细胞接种至直径90～150μm的塑料微载体(Synthecon公司，休斯顿，美国)上，血清饥饿10～15小时后，用预处理培养液预处理1～3小时，然后在模拟微重力环境下用成骨诱导液进行诱导培养14～28天； 

所述预处理培养液终浓度组成如下： 

SB203580     1μmol/L 

BMP-2        250ng/mL 

FGF2         20ng/mL 

5-aza-CdR    20μmol/L 

溶剂为DMEM培养液； 

所述成骨诱导培养液终浓度组成如下： 

SB203580     1μmol/L 

BMP-2        250ng/mL 

FGF2         20ng/mL 

5-aza-CdR    20μmol/L