[发明专利]一种新型农药靶标酶海藻糖酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明是关于一种新型农药靶标酶海藻糖酶的制备方法，属于生物化工领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种非还原性二糖，目前被认为是害虫的特征血糖，在所有已检测的害虫中都发现了这种血糖，它主要用于满足害虫的各种需能活动。海藻糖水解酶(Trehalase，简称海藻糖酶)是唯一可以专一性地将海藻糖水解成为2分子葡萄糖单体的水解酶，在昆虫和真菌代谢系统中有十分重要的作用，是重要的代谢酶。

海藻糖酶首先是在1893年由Bourquelot在黑曲霉中发现的。在自然界中，海藻糖酶广泛存在于昆虫、哺乳动物、微生物和植物中。海藻糖酶在昆虫组织中以两种不同的形式存在，一种是可溶性的海藻糖酶，游离于细胞质中，主要存在于小肠与脑组织中；另一种是颗粒状的海藻糖酶。哺乳动物中海藻糖酶的含量不高。微生物中的海藻糖酶包括中性海藻糖酶和酸性海藻糖酶。酸性海藻糖酶一般在pH值4.5左右具有最大活性，是非调节酶，在酵母中存在于液泡中，在丝状真菌中则位于细胞壁上；中性海藻糖酶一般在pH值7.0左右具有最大活力，主要存于细胞质中，在细胞生长的不同时期具有不同活力。在细菌和真菌的孢子萌发以及感染过程中，海藻糖酶也发挥着重要的功能。在高等植物的各个部位也存在着海藻糖酶。如果海藻糖累积，可能会使植物体内的糖代谢途径产生混乱，因此海藻糖酶对高等植物有十分重要的意义。目前，已经从昆虫、哺乳动物、微生物和植物等分离得到了海藻糖酶，其中昆虫来源的海藻糖酶研究最多。

随着人类文明的发展，环保意识越来越深入人心。传统化学农药存在污染严重、药效低、对人畜危害大等缺点。1972年，我国规定了新农药的发展方向，即发展低毒、高效的新农药，逐步发展生物农药。在新农药品种开发过程中，强调高活性的同时更加注重与环境的相容性，高效低毒、选择性强、对非靶标生物安全、环境友好成为新农药的追求目标。很多新开发的超高活性的新农药的靶标都是靶标生物中重要的代谢酶。这些新农药通过干扰或抑制杂草和昆虫内的代谢活动而造成杂草和昆虫的死亡，这些代谢过程往往由不同的靶标酶系统所控制。新农药通过干扰或抑制杂草和昆虫内的代谢活动而发生作用，由于哺乳动物没有海藻糖代谢系统，以海藻糖酶为靶标开发的新农药对人畜等非靶标生物无毒害作用。因此，海藻糖酶是目前研究很热门的一种新型的农药靶标酶。

目前已报道的海藻糖酶的制备方法有很多，如采用凝胶层析、疏水层析和离子交换层析等分离技术，也得到了较高纯度的产品。但是作为一种新型的农药靶标酶，其应用范围广，用量大，考虑到实际生产和经济成本的需要，本发明提供一种原料来源方便，简单操作易行的海藻糖酶的制备方法，为海藻糖酶的工业化生产提供有效的途径。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新型农药靶标酶海藻糖酶的制备方法。

本发明所说的海藻糖酶的制备方法，是以家蚕为原料，用硫酸铵分级沉淀法得到粗酶液，经透析后用丙酮溶液纯化后离心干燥得到海藻糖酶。

本发明的技术解决方案如下：

(1)粗酶液的提取

称取家蚕，加入冰磷酸缓冲液中，然后用组织捣碎机搅拌，冷冻离心，收集上清液。即为酶粗提液。

(2)粗提液的纯化

粗提液中加入(NH₄)₂SO₄使之分别达到相应的饱和度，分别搅拌离心，分别收集各阶段的沉淀。将所得的沉淀溶于磷酸缓冲液保存。用磷酸缓冲液透析，所得透析液用冰盐浴冷却，一段时间后，搅拌加入预冷的丙酮溶液，离心去除沉淀，上清液中再加入丙酮液，然后离心收集沉淀。合并两次所得到的沉淀，将其真空干燥即得到海藻糖酶。

本发明所用的原料来源广泛，采用的方法操作简单且所用的化学试剂均可回收利用，节约了成本。该法对于海藻糖酶的工业化生产提供了新的途径。